低氧对骨髓间充质干细胞生物学的影响

　　作者：宋玮玮,白海,王存邦,鱼丽莉,欧剑锋　　作者单位：甘肃省兰州大学第二临床医学院 　2.730050 甘肃省兰州军区兰州总医院血液科 　3.730000 甘肃省兰州大学第一临床医学院

　　【摘要】 目的探讨低氧对骨髓间充质干细胞(hMSCs)增殖的影响。方法从人骨髓中分离培养MSCs,流式细胞术检测其纯度;建立缺氧模型，MTT法检测人骨髓间充质干细胞在不同时间(0、12h、1d、2d、4d、6d、7d)的增殖情况。结果 急性缺氧期内，hMSCs增殖被抑制;此后出现增殖，与对照组比较，人骨髓间充质干细胞经150μmol/L COCl2作用24h出现显著增殖(P<0.01)。结论 缺氧在一定时间内可以促进hMSCs增殖。

　　【关键词】 间充质干细胞,低氧,增殖,人

　　【Abstract】 Objective hypoxia on mesenchymal stem cells (hMSCS) proliferation. Methods isolated and cultured from human bone marrow MSCs, flow cytometry and the purity; established hypoxia model, MTT assay of human bone marrow mesenchymal stem cells at different times (0,12 h, 1d, 2d, 4d, 6d, 7d ) of proliferation. Results of acute hypoxia period, hMSCs proliferation was inhibited; then appear proliferation compared with control group, human bone marrow mesenchymal stem cells were 150μmol / L COCl2 24h, significant proliferation occurred (P<0.01). Conclusion and hypoxia in a certain period of time can promote the proliferation of hMSCs.

　　【Key words】MSC; Hypoxia; Proliferation; Human

　　骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)是一群具有多种分化潜能的多能干细胞，能最终分化成骨、软骨、肌腱、肌肉、神经和脂肪组织[1-2]，且在体外易分离培养，还易于外源基因的转染和表达，可享有免疫特权。近年来人们发现MSCs还具有抑制同种异体免疫反应、减轻移植物抗宿主效应的作用，以上发现使得MSCs在组织工程、HSC移植、器官移植及自身免疫性疾病领域有着广泛的应用前景。但hMSCs在体外增殖较慢，因此，如何实现少量取样批量获取以满足临床需要，是hMSCs应用研究的当务之急。我们通过建立体外低氧环境，将不同程度的化学性低氧作用于体外培养的 hMSCs，旨在探讨不同程度的低氧对hMSCs增殖的影响，发展hMSCs快速扩增的方法。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　骨髓是由健康志愿者捐赠。DMEM培养基购自 Gibeco公司。PE标记的鼠抗人流式单克隆抗体(PharMingen公司，美国)、四甲基偶氮唑蓝(MTT)、二氯化钴(CoCl2)均购自美国Sigma公司, 流式细胞仪(Beckman Coulter公司，美国)，酶标仪(Wellseav MK2型全自动酶标仪，Labsystem公司，芬兰)胎牛血清(杭州四季青)，倒置相差显微镜(奥林巴斯公司，日本)。

　　1.2 hBMSCs分离、培养

　　无菌条件下抽取健康供者骨髓，肝素抗凝，用DMEM培养液倍比稀释，缓慢移至等量淋巴细胞分离液上，1500×g离心20min，吸取中间乳白色单个核细胞层,培养液洗涤两次。细胞重悬于含10%新生牛血清的培养液中，细胞计数1×105并接种于培养瓶内，置37℃, 5%CO2 ,饱和湿度的孵箱内培养,细胞融合度达80%时传代培养,取第4 代对数生长期的细胞进行实验。并在倒置相差显微镜下观察细胞形态并摄像。

　　1.3 流式细胞仪检测细胞表面标志物

　　含0.02% EDTA的0.25%胰蛋白酶消化第3代hMSCs，PBS轻轻吹打收集细胞并制成细胞悬液，调整细胞浓度为1×106个/50L，分别与CD34、CD44、CD45、CD71、HLA-DR单克隆抗体室温避光反应15min，以流式细胞术检测细胞表面标记。Cell-Quest软件分析，每个样本至少分析10000个细胞。

　　1.4 MTT细胞增殖试验

　　选用第3代的细胞，将细胞制备成1×107/L的细胞悬液，接种到 96孔细胞培养板，每孔180μL, 3000个/孔。孵育24h,换无血清培养液孵育24h，加入培养基20μL，含CoCl2 (0和150μmol /L ) ，继续避光培养 ( 12h、1d、2d、4d、6d和7d)。实验结束前4h每孔加入MTT(5g/L)溶液20μl，结束前每孔加入二甲基亚砜 150μL，置摇床上低速振荡10min。在酶联免疫检测仪570nm处测量各孔的吸光度值 (A)。每次每组检测6个孔，并根据A值绘制细胞生长曲线。

　　1.5 统计学处理

　　所有实验数据以均数±标准差(x±s)表示，数据采用SPSS16.0软件分析，多组间比较用one way ANOVA方差分析。

　　2 结果

　　2.1 骨髓间充质干细胞形态观察

　　连续显微镜下观察发现,正常骨髓接种后3 d即出现大量贴壁的梭形细胞，形态类似于成纤维细胞,部分贴壁细胞呈三角形或多角形，1周后贴壁细胞呈典型的长梭形外观，可呈旋涡状、网状、辐射状或平行状生长。高倍镜下观察发现,贴壁生长的细胞其核较大,逐渐呈圆形或类圆形外观，多数居中，少数易位,核染色质呈粗颗粒状，分布欠均匀，核仁隐约可见，胞浆丰富，呈紫红色，部分胞浆可见空泡。14 d左右贴壁细胞逐渐融合。传代细胞在1 h内完全贴壁，重新变为长梭形细胞。细胞传代后生长迅速，大约1 d即可达到融合。

　　2.2 骨髓细胞表面分子的鉴定

　　流式细胞术检测MSCs细胞表面抗原结果显示高表达CD44、CD71，而CD34、CD45、HLA-DR表达阴性。

　　2.3 低氧对骨髓间充质干细胞增殖的影响

　　CoCl2模拟的化学性低氧促进了间充质干细胞的增殖，并且这种促增殖作用具有一定的时间依赖性，随着时间的延长，12h时常氧组的增殖大于低氧组(P<0.05)，1d、2d和4d时 150μmol/L低氧组表现出明显的增殖(P<0.01)。6d时150μmol/L低氧组增殖的优势逐渐减弱(P>0.05)，7d时这种低氧促增殖的效应消失。

　　3 讨论

　　近年来随着细胞工程学的迅猛发展，利用hMSCs的多向分化潜能及其低免疫原性等特性，将其作为种子细胞用于基因治疗和细胞治疗的应用研究已成为研究的热点。如何获得大量纯化的hMSCs成为临床利用这些细胞治疗疾病的前提。

　　细胞外氧浓度是影响细胞生物学功能的重要因素，在之前的不同细胞缺氧模型研究中，提示低氧浓度影响细胞的增殖和分化。Deren等[3]在体外采用低氧培养牛骨膜细胞时，发现细胞增殖速度明显提高。3%O2能促进鼠中脑前体细胞增殖，提高生长率。Lennon等[4]在体外培养大鼠骨髓间充质干细胞(rMSCs)时，发现低氧能提高rMSCs体外增殖。目前已有实验证明低氧对细胞的作用可由CoCl2模拟[5]。Co2+可替代氧感受器血红素中的 Fe2+，将此分子锁定在脱氧合状态。如果用 CoCl2阻断氧感受器与氧结合，则会使细胞在不缺氧的环境下“感觉”缺氧。

　　在我们的研究中发现，这种化学性低氧促进了hMSCs的增殖，并且这种增殖具有一定的时间依赖性，在急性缺氧期(12h时)细胞增殖受到抑制，此后出现增殖，在缺氧24h时，增殖最为明显，大约在培养的第7天时化学性低氧促进细胞增殖的优势就消失了。关于低氧调节细胞增殖的机制，多集中在低氧对肿瘤细胞的促增殖研究上[7]。普遍认为，低氧可诱导细胞产生一种称为低氧诱导因子-1(HIF-1)的转录因子[8]，活化的HIF-1与其靶基因上的低氧反应元件结合,形成转录起始复合物启动靶基因的转录。已确定的HIF-1靶基因约有50种[9]，它们编码的蛋白质参与细胞的多种代谢、细胞增殖、凋亡、肿瘤生长等诸多功能。本文提出并证明了化学性低氧能促进hMSCs的体外增殖,这对hMSCs的批量获取及其作为一种免疫调节细胞应用于治疗移植排斥疾病具有重要的意义。至于低氧调节 hMSCs 增殖的机制,还有待进一步深入探讨。

　　【参考文献】

　　[1]Bianco P, Riminucci M, Gronthos S, et al. Bone marrow stromal stem cells: nature, biology, and potential applications. Stem Cells , 2001, 19: 180-92

　　[2]Zhao LR, Duan WM, Reyes M, et al. Human bone marrow stem cells exhibit neural phenotypes and ameliorate neurological deficits after grafting into the ischemic brain of rats. Exp Neurol , 2002, 174: 11-20

　　[3]Deren JA, Kaplan FS, Brighton CT. Alkaline phosphatase production by periosteal cells at various oxygen tensions in vitro. Clin Orthop Relat Res , 1990, 307-12

　　[4]Lennon DP, Edmison JM, Caplan AI. Cultivation of rat marrow-derived mesenchymal stem cells in reduced oxygen tension: effects on in vitro and in vivo osteochondrogenesis. J Cell Physiol , 2001, 187: 345-55

　　[5]Yun Z, Maecker HL, Johnson RS, et al. Inhibition of PPAR gamma 2 gene expression by the HIF-1-regulated gene DEC1/Stra13: a mechanism for regulation of adipogenesis by hypoxia. Dev Cell , 2002, 2: 331-41

　　[6]Pacary E, Legros H, Valable S, et al. Synergistic effects of CoCl(2) and ROCK inhibition on mesenchymal stem cell differentiation into neuron-like cells. J Cell Sci , 2006, 119: 2667-78

　　[7]Kim W, Kaelin WG, Jr. The von Hippel-Lindau tumor suppressor protein: new insights into oxygen sensing and cancer. Curr Opin Genet Dev , 2003, 13: 55-60

　　[8]Minet E, Michel G, Mottet D, et al. Transduction pathways involved in Hypoxia-Inducible Factor-1 phosphorylation and activation. Free Radic Biol Med , 2001, 31: 847-55

　　[9]Semenza G. Signal transduction to hypoxia-inducible factor 1. Biochem Pharmacol , 2002,64: 993-8