褪黑素联合全反式维甲酸对HL-60细胞作用的研究

　　作者：刘沁华,夏瑞祥,李嘉嘉　　作者单位： 合肥 安徽医科大学第一附属医院血液科

　　【摘要】目的观察褪黑素联合全反式维甲酸对人早幼粒细胞白血病细胞株HL-60的增殖、凋亡、分化及细胞周期的影响。方法 以1 mmol/L褪黑素与1μmol/L全反式维甲酸联合作用于HL-60细胞,药物作用24 h、48 h、72 h后进行试验。以姬姆萨染色观察细胞形态变化，以CCK-8的方法检测药物的抑制率，以流式细胞术检测细胞凋亡率，细胞膜表面抗原CD11b的表达阳性率，及细胞周期的变化情况。结果 褪黑素联合全反式维甲酸作用于HL-60细胞，细胞逐渐出现凋亡，其抑制率24 h、48 h和72 h分别为0.31±0.02，0.57±0.06和0.83±0.04，其促进细胞凋亡的比例为15.67±2.38%，26.93±1.60%和50.13±1.76%，其细胞表面CD11b的阳性率为20.98±0.46%，58.96±6.05%和83.80±2.48%;其对细胞周期的影响表现为G1期细胞增多(69.3±0.5%、75.2±0.1%和85.3±0.1%)，S期细胞减少(20.1±0.1%、23.2±0.5%和9.2±0.2%)，均优于单用褪黑素组或全反式维甲酸组(P<0.05)。结论 褪黑素联合全反式维甲酸可以抑制HL-60细胞的增殖、促进其凋亡，诱导其分化，影响其细胞周期，联合用药的作用优于单用褪黑素组或全反式维甲酸组。

　　【关键词】 褪黑素,全反式维甲酸,增殖,凋亡,分化,细胞周期

　　[Abstract] Objective To investigate the effects of melatonin(MLT) and all trans retinoic acid (ATRA)on HL-60 cells.Methods The HL-60 cells were treated with 1mmol/L MLT and 1μmol/L ATRA together for different duration(24,48 and 72h) in culture.The morphology of cells was observed after Giemsa dying.The growth of HL-60cells was studied by measurement of CCK-8,while the apoptosis ,expression of CD11b and cell cycle were measured by flow cytometry.Results After treated with MLT and ATRA together for 24,48 and 72h, the reduction of the growth of HL-60 cells was 0.31±0.02，0.57±0.06 and 0.83±0.04，the ratio of apoptotic cell death was15.67±2.38%，26.93±1.60% and 50.13±1.76%，the expression of CD11b was 20.98±0.46%，58.96±6.05% and 83.80±2.48%， the ratio of G1 phase cells was 69.3±0.5%、75.2±0.1% and 85.3±0.1%,while S phase cells was 20.1±0.1%、23.2±0.5% and 9.2±0.2%.All results were more obvious than those treated with MLT or ATRA alone (P<0.05).Conclusion Treated with MLT and ATRA together, the reduction of the growth of HL-60 cells , the increasing of apoptotic cell death or differentiation ,and the inhibition of progression from G1 to S phase of the cell cycle were more obvious than those treated with MLT or ATRA alone.

　　[Key words] Melatonin,All trans retinoic acid,Apoptosis,Death,Differentiation,Cell cycle

　　褪黑素(melatonin,MLT)是由松果体分泌的一种吲哚类神经内分泌激素。近来有研究发现褪黑素对白血病细胞株具有抑制作用[1，2]。我院的前期研究也证实褪黑素对NB4细胞株具有抑制作用，但诱导分化作用不明显[3]。而全反式维甲酸(all trans retinoic acid ,ATRA)常用的诱导分化药物，其促凋亡作用不明显。本研究以褪黑素和全反式维甲酸联合作用于HL-60细胞株，观察其在凋亡、分化及细胞周期等方面的变化。

　　1 资料与方法

　　1.1 材料 HL-60细胞株由苏州医学院血液病研究所惠赠;胎牛血清购自杭州四季青公司;碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)， RNA酶、MLT和ATRA均购自Sigma公司。MLT和ATRA均用无水乙醇配制成10-2mol/L的储存液，-20 ℃避光保存，乙醇终浓度小于0.01%; RPMI 1640购自Gibco公司; Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒购自凯基生物科技发展有限公司; PE(藻红蛋白)标记的鼠抗人CD11b单克隆抗体及同型对照抗体均为法国IMMUNOTECH公司产品;Flow-Check、Flow-Set、CYTO-trol质控细胞、CYTO-COMP试剂盒、TetraONE系统分析软件、流式细胞仪EPICS XL-MCL均为美国Beckman-coulter公司产品。

　　1.2 细胞培养 将HL-60细胞以1×105/mL的浓度接种于含10%胎牛血清、青霉素100 U/mL和链霉素100 μg/mL 的RPMI 1640培养液中，置于37 ℃、饱和湿度条件下，体积分数为5%的CO2培养箱中培养。取指数生长期的细胞进行实验。

　　第31卷第7期2010年7月 刘沁华等：褪黑素联合全反式维甲酸对HL-60细胞作用的研究1.3 形态学观察 显微镜下观察细胞生长状态;取对数生长期白血病细胞，同时加入1 mmol/L MLT和1 μmol/L ATRA，培养24 h、48 h和72 h后，离心、涂片;10%的姬姆萨染液染色2 min，在显微镜下观察细胞形态学的改变情况。

　　1.4 生长抑制率的测定 取对数生长期HL-60细胞，以1×104/mL接种于96孔板中，分别加入1 mmol/L MLT、1 μmol/L ATRA和1 mmol/L MLT+1 μmol/L ATRA。每种药物设立实验组4孔、细胞对照组2孔、药物对照组1孔，每块96孔板另设立培养液对照组2孔。实验组为HL-60细胞悬液100 μL+药物溶液10 μL;细胞对照组为HL-60细胞悬液100 μL+三蒸水10 μL;药物对照组为培养液100 μL+本组药物溶液10μL;培养液对照组为培养液100 μL+三蒸水10 μL。96孔板在37 ℃，5%CO2，饱和湿度条件下培养24 h、48 h和72 h。在每个孔内加入10 μL的CCK-8试剂，把培养板放在培养箱内继续培养3～4 h，取出置于4 ℃ 15 min终止反应，在酶联免疫检测仪在450 nm波长下检测吸光度。用每组药物对照孔调零，测定本组实验孔的吸光度;用培养液对照孔调零，测定细胞对照孔的吸光度。生长抑制率计算公式：生长抑制率(%)=(1-实验组平均吸光度/细胞对照组平均吸光度)×100%。

　　1.5 细胞凋亡的检测 取对数生长期HL-60细胞，以5×105/mL密度接种于24孔板内，分别加入1 mmol/L MLT、1 μmol/L ATRA和1 mmol/L MLT+1 μmol/L ATRA。细胞培养24 h、48 h和72 h后收集各组细胞，PBS洗涤细胞两次，调整细胞密度5×105/mL加入流式专用上样管，管中加入500 μL Binding Buffer悬浮细胞，然后加入5 μL Annexin V-FITC，混匀后，再加入5 μL PI，混匀。室温避光反应15 min，1 h内在流式细胞仪上进行检测。以Annexin V+/PI-判断为凋亡。

　　1.6 细胞分化的检测 取对数生长期HL-60细胞，分别加入1 mmol/L MLT、1 μmol/L ATRA和1 mmol/L MLT+1 μmol/L ATRA。细胞培养24 h、48 h和72 h后，收集各组细胞，调整细胞密度为1×106/mL，取细胞悬液200 μL，加入5 μL PE标记的鼠抗人CD11b单克隆抗体及同型对照用IgG抗体。使用同型对照调节电压建立方案，以同型对照阳性率低于2%，大于0%为标准进行设门。上机时，检测2×105个目标细胞，门内细胞占目标细胞的百分率即阳性率。混匀后室温孵育15 min，加入400 μL PBS溶液，流式细胞仪检测。

　　1.7 细胞周期的检测 取对数生长期HL-60细胞，分别加入1 mmol/L MLT、1 μmol/L ATRA和1 mmol/L MLT+1 μmol/L ATRA。细胞培养24 h、48 h和72 h后，收集各组细胞，离心，PBS洗涤2次，加入-20 ℃预冷的70%乙醇固定24 h以上。检测前去除乙醇，PBS洗涤2次，加入混合染液500 μL，常温避光染色30 min后上流式细胞仪检测，检测2×104细胞。混合染液配方为柠檬酸三钠0.25 g，Triton X-100 0.75 ml，PI 0.03 g，RNAease 0.01 g，终体积250 ml。

　　1.8 统计学处理 流式细胞仪结果采用SYSTEM32、Multicycle和TetraONE系统分析软件进行分析，所有数据以±s表示，采用SPSS 10. 0 软件进行统计学分析，组间变量采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 褪黑素联合全反式维甲酸对HL-60细胞作用的形态学观察 1 mmol/L褪黑素联合1 μmol/L全反式维甲酸作用于HL-60细胞株，培养24 h后，细胞出现肿胀;培养48 h后，细胞肿胀更加明显，且出现明显的空泡变性;培养72 h后，细胞出现明显核固缩现象。见图1。

　　图1 1 mmol/L MLT联合1μmmol/L ATRA作用于HL-60细胞(×1000)(A：未加药细胞;B：作用24 h;C：作用48 h;D：作用72 h)2.2 褪黑素联合全反式维甲酸对HL-60细胞增殖的影响 褪黑素联合全反式维甲酸作用于HL-60细胞，随着作用时间的延长，抑制率增加差异有统计学意义(P<0.05)，与1mM MLT组和1μM ATRA组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1，图2。表1 褪黑素联合全反式维甲酸对HL-60细胞生长的抑制作用注：合用组72 h分别与24 h、48 h比较：△P<0.05;72 h时间点合用组分别与MLT和ATRA组比较：*P<0.05

　　图2 褪黑素联合全反式维甲酸对HL-60细胞生长的抑制作用2.3 褪黑素联合全反式维甲酸对HL-60细胞凋亡的影响 褪黑素联合全反式维甲酸可以显著增加HL-60细胞的凋亡率，其促凋亡作用明显强于单用MLT组和ATRA组, 差异有统计学意义(P<0.05);且随着时间的延长，其促凋亡作用也随之增强,差异有统计学意义(P<0.05)。见表2表2 褪黑素联合全反式维甲酸对HL-60细胞凋亡的影响注：合用组72 h分别与24 h、48 h比较：△P<0.05;72 h时间点合用组分别与MLT和ATRA组比较：*P<0.05

　　2.4 褪黑素联合全反式维甲酸对HL-60细胞分化的影响 褪黑素联合全反式维甲酸可以显著增加HL-60细胞的分化，随着时间的延长，其促分化作用也随之增强，(P<0.05)。其促分化作用明显强于单用ATRA组，也强于单用MLT组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表3。表3 褪黑素联合全反式维甲酸对HL-60细胞分化的影响：合用组72 h分别与24 h、48 h比较：△P<0.05;72 h时间点合用组分别与MLT和ATRA组比较：*P<0.05

　　2.5 褪黑素联合全反式维甲酸对HL-60细胞周期的影响 褪黑素联合全反式维甲酸可以显著影响HL-60细胞的周期，G1期细胞增多，S期细胞减少，随着时间的延长，这种作用也随之增强，差异有统计学意义(P<0.05)。合用效果明显强于单用ATRA组，也强于单用MLT组差异有统计学意义(P<0.05)，见表4。表4 褪黑素联合全反式维甲酸对HL-60细胞周期的影响注：G1期：合用组72 h分别与24 h、48 h比较：△P<0.05;72 h时间点合用组分别与MLT和ATRA组比较：*P<0.05

　　S期：合用组72 h分别与24 h、48 h比较：◇P<0.05;72 h时间点合用组分别与MLT和ATRA组比较：P<0.05

　　3 讨论

　　褪黑素具有抗氧化、免疫调节、抗肿瘤等多种生物学效应。体外研究发现，10-3M的MLT对CMK, Jurkat 和MOLT-4细胞有中等程度的细胞毒性作用，而K562, Daudi, HL-60等细胞则不受MLT的影响[1]。但是一些国外研究[2,3]和我院研究均发现MLT对HL-60细胞增殖是有抑制作用的，而且这种作用存在明显的量效和时效关系。我院也对NB4细胞进行过研究，结果与之相似[4]。这种抑制作用都是通过MLT促进白血病细胞凋亡，影响其细胞周期而实现的，对其分化则没有影响。而全反式维甲酸主要是通过诱导白血病细胞向成熟粒细胞方向分化来实现其治疗作用的[5]。虽然也有研究发现ATRA也有促凋亡作用，但一般较弱，且发生较晚[11]。

　　本研究将MLT和ATRA联合作用于白血病细胞，形态学上发现，随着联合作用时间的延长，HL-60细胞出现细胞核增大、分叶，同时细胞肿胀，出现空泡、核固缩等征象，与流式细胞仪定量观察到的促凋亡和促分化双重作用是一致的。由于从形态学上很难对联合用药和单药作用的效果做出客观的比较，所以本研究未进行单药作用的形态学观察。联合用药可以明显抑制HL-60细胞的增殖，具有促凋亡和促分化作用的双重作用，且存在明显的时效关系。同时联合用药的效果优于单用褪黑素的促凋亡作用以及单用全反式维甲酸的促分化作用，提示两药合用并不是各自促凋亡和促分化作用简单地相加，而是存在相互作用、相互影响的情况。

　　褪黑素和全反式维甲酸联合作用于其他肿瘤细胞株的研究已有报道。如序贯应用褪黑素和全反式维甲酸治疗乳癌细胞株MCF-7，可使其凋亡显著增加[6]，同时，用褪黑素预处理的细胞对全反式维甲酸的敏感性增加，引起相同凋亡程度所需ATRA的浓度可以降低0.1%～1.0%[7]。同时，临床上也有一些采用MLT联合化疗药物对白血病患者进行治疗获得成功的个案报道。如Lissoni 等[8]采用皮下注射低剂量IL-2，同时口服褪黑素的方法对1名急性髓系白血病患者和1名慢性粒单细胞白血病患者进行治疗，病情稳定没有进展的时间达到21个月(14～30个月)以上。而在2009年的一篇研究[9]则报道了MLT联合维甲酸、环磷酰胺、生长抑素、溴隐亭和ACTH治疗4例慢性淋巴细胞白血病患者，患者疾病无进展生存期分别达到125个月、121个月、73个月和21个月，而且仍在继续。这些研究都提示联合褪黑素和全反式维甲酸对白血病的治疗可能具有一定的价值。

　　联合应用褪黑素和全反式维甲酸产生相互作用的机制目前尚不清楚。有观点认为，褪黑素通过其G蛋白偶联的膜受体调节cAMP的水平，而后者可以影响维甲酸受体(RAR)的转录，使得维甲酸的作用增强[10]。但是与之矛盾的是，褪黑素对HL-60细胞的生长抑制作用是不依赖于褪黑素受体的[2]。有研究[11,12]通过对ATRA对HL-60细胞作用的时相性研究发现，ATRA先使得HL-60细胞阻滞在G1早期到G1晚期;然后ATRA诱导白血病细胞向成熟方向分化，但并未使其完成终端分化，分化完成于细胞周期中的G1早期;最后发生细胞凋亡，且随着分化细胞的增多，细胞凋亡峰也越明显。所以是否存在这样的可能：即褪黑素和维甲酸同时给药后，维甲酸先诱导白血病细胞发生细胞周期阻滞，然后产生分化，褪黑素再使已部分分化的白血病细胞凋亡。这种推测还需进一步试验加以证实。

　　总之，褪黑素联合全反式维甲酸对白血病细胞的作用优于单用褪黑素或全反式维甲酸，可以作为白血病治疗研究的一个新的方向，值得进一步研究。

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