低氧环境对大鼠血清促血管生成素-1水平的影响及沙利度胺的干预效应

　　作者：肖建红1 李占全2 朱德锐1 作者单位：青海大学医学院;2.青海大学附属医院血液科)

　　【摘要】 目的 观察低氧环境对大鼠血清促血管生成素-1(angiopoietin-1, Ang-1)水平的影响，并探讨低氧条件下血管生长抑制剂沙利度胺对血清Ang-1水平的干预效应。方法 采用低压氧舱模拟4000m海拔的高原低压低氧环境。将实验动物分为低氧组、沙利度胺预防组和沙利度胺治疗组，经不同时间的低氧处理及沙利度胺干预后，测定血清Ang-1的水平，并与对照组进行比较分析。血清Ang-1的测定采用固相双抗体夹心酶联免疫吸附实验(ELISA)法测定。结果 低氧组大鼠血清Ang-1浓度呈现随低氧时间的延长而不断上升的趋势;各组与对照组间血清Ang-1浓度存在显著差异(P<0.01)。采用沙利度胺进行预防性干预后土鼠血清Ang-1水平仍呈持续增高，但增幅显著降低。经沙利度胺治疗后，治疗组血清Ang-1水平恢复到对照组水平。结论 在低氧环境中，大鼠血清Ang-1浓度呈现随低氧时间的延长而不断增高的趋势;沙利度胺可部分阻止低氧引起的大鼠血清Ang-1的增高;沙利度胺对低氧引起的血清Ang-1水平增高具有治疗作用。沙利度胺在低氧引起的血管增生性疾病的预防和治疗中可能具有一定的作用。 肖建红(1980～)，女，羌族，四川籍，讲师，硕士

　　【关键词】 低氧 促血管生成素-1 沙利度胺

　　THE INFLUENCE OF HYPOXIA ON THE LEVELOF ANGIOPOIETIN-1 IN RAT, AND THE EFFECT OFTHALIDOMIDEXiao Jianhong1 , Li Zhanquan2，Zhu Derui1(1. Qinghai University Medical College; 2. Qinghai University Affiliated Hospital)Abstract Objective observe the serum levels of angiopoietin-1 (Ang-1) in the hypoxic environment and to reveal the interferential effects of blood growth inhibitors-thalidomide on serum Ang-1 in the same condition. Methods By means of low pressure oxygen chamber, the low pressure hypoxic environment at 4000-meter-high plateau was simulated. Experimental animals were divided into three groups as the hypoxic group, the preventive group with stopped reaction and the treated group by using thalidomide. After various periods of hypoxic treatment and intervention thalidomide, Serum Ang-1 was measured and compared with control group. Serum Ang-1 was detected by using solid-phase double-antibody sandwich enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Results The concentrations of the serum Ang-1 of the rats in hypoxic group increased with the extension of hypoxic time. Significant differences were found among those groups(P<0.01)even though preventive intervention implemented by thalidomide could not block the increase of serum Ang-1 level, it decreased the raising extent with big margin. After thalidomide treatment, the serum Ang-1 levels of treatment group returned to that of the control group without much difference. Conclusion The results above show that the concentrations of the serum Ang-1 of the rats increase with the extension of hypoxic time. Thalidomide, in part, could block the increase of serum Ang-1 level. Thalidomide has treatment effect on the decrease of the serum Ang-1 level caused by hypoxic environment. For vascular proliferating disease caused by hypoxic environment, thalidomide plays a certain role in the prevention and treatment of the disease to some extent.

　　Key words Hypoxia Angiopoietin-1 Thalidomide

　　Ang-1是新近发现与血管形成密切相关的蛋白生长因子 [1]。Ang-1及其受体Tie-2在血管新生过程中对新生血管的形成、重塑、成熟等发挥重要的调节作用。血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)与Ang-1作用于不同的环节，而且在很多方面Ang-1可以弥补VEGF的不足[2]，如Ang-1可以促进内皮细胞周围支持细胞的聚集，使新生血管结构完整，不易渗漏，具有维持血管的稳定性和完整性的作用[3]。当机体细胞处于低氧状态，可启动血管增生因子的表达，引起血管内皮细胞的增生，形成新的血管，以满足自身的营养供应。在缺氧条件下血管增生因子的相关研究中对VEGF的研究和报道较多，但未见对Ang-1的研究报道。

　　为了探讨低氧条件下机体内Ang-1的变化以及沙利度胺的干预效应，本研究模拟海拔4000m低压低氧条件建立大鼠缺氧模型，观察在低氧条件下大鼠血清Ang-1的变化，同时观察沙利度胺干预对慢性缺氧条件下大鼠血清Ang-1的影响。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物

　　实验动物为成年雄性封闭群纯种Sprague-Dawley大鼠，来源于第四军医大学动物中心，动物合格证号:医动证字SC×K(军)2007 02。

　　1.2 主要试剂

　　ELISA试剂盒由上海船夫生物科技有限公司提供。

　　1.3 实验设计

　　将实验动物随机分成7组，每组12只。对照组在西宁地区(海拔2260 m)自然条件下饲养;低氧组(3组)每天置于模拟海拔4000 m 的环境8 h，分别放置1天、7天和21天;预防组(2组)在低氧实验的整个过程中每天予沙利度胺(50mg/Kg)灌胃，分别放置7天和21天;治疗组在低氧实验第4周开始每天予沙利度胺(100mg/Kg)灌胃，连续2周。全部实验动物在预定时间从腹腔静脉采集血标本进行血细胞学分析，并分离血清进行Ang-1测定。各组实验动物体重和Hb浓度经统计学处理无差异。

　　1.4 标本的采集、分离及保存

　　从实验大鼠腹腔静脉采集空腹血5ml，置于清洁血清分离管中，室温下自然凝固后离心(4000rpm)10min，收集血清分装后置-196℃冰箱保存。测定前2h放置于室温，自然解冻。

　　1.5 测定方法

　　采用固相双抗体夹心ELISA法利用DNX-9620电脑洗板机及Metertech∑960型酶标仪测定血清Ang-1。试剂盒标准曲线相关系数均在0.99以上。

　　1.6 统计学方法

　　数据以x±S表示，组间比较分析采用方差分析和LSD检验，运用SPSS13.0软件进行统计学处理。

　　2 结果

　　低压低氧条件下和沙利度胺干预及治疗后大鼠血清Ang-1水平测定结果见表1。

　　3 讨论

　　Ang-1是继VEGF之后发现的又一内皮细胞特异性的促血管新生因子[4]。Ang-1最初是由Davis[5]等用分子克隆技术发现并成功克隆。当机体细胞处于低氧状态时Ang-1、VEGF、bFGF等血管生长因子的表达增强，引起血管内皮细胞的增生，形成新的血管，以满足自身的营养供应 [6]。本研究结果显示，低氧7天组和低氧21天组血清Ang-1水平显著高于对照组，且低氧21天组又显著高于低氧7天组，Ang-1水平呈现出随着低氧时间延长不断升高的趋势，这一结果与VEGF、bFGF在缺氧状态下的变化相一致[5，6]。表1低压低氧条件下和沙利度胺干预、治疗后大鼠血清Ang-1浓度( x±S)

　　组 别NAng-1(mg/L)P值(与对照组比较) 对照组77.17±0.48低氧1天组77.56±0.67>0.05低氧7天组118.73±0.29#<0.05低氧21天组119.26±0.44#★<0.05预防7天组88.03±0.47▼<0.05预防21天组108.62±0.75▼*<0.05治疗组107.18±0.50>0.05 注:▼与低氧同期组比较，P<0.05; #与低氧1天组比较, P<0.05;★与低氧7天组比较, P<0.05;*与预防7天组比较，P<0.05.

　　在血管生成抑制剂中，沙利度胺直接作用于血管内皮细胞，既可以直接抑制内皮细胞的增殖活性，又可以抑制Tie-2、VEGFR、FGFR的分泌[9,10]。1994年D'Amato RJ 等首次报道沙利度胺可明显减少兔角膜受Ang-1刺激后的血管新生[11]，接下来的一些研究肯定了沙利度胺的抗血管生成效应[12]。基于上述抗血管生成等作用，沙利度胺已被用于恶性肿瘤和恶性血液病的临床治疗[13]。本研究结果显示，预防7天组血清Ang-1水平显著高于对照组，但低于低氧7天组(P<0.05);预防21天组比预防7天组显著增高，却显著低于低氧21天组(P<0.05)。这表明，经预防性沙利度胺干预，虽不能阻断低氧引起的血清Ang-1水平增高，但显著降低了增高幅度。经沙利度胺治疗后，治疗组血清Ang-1水平恢复到对照组水平，提示沙利度胺对低氧引起的血清Ang-1水平增高具有良好的降低作用。

　　本研究结果提示，缺氧对Ang-1的影响作用与沙利度胺对其干预作用相似。血管生成抑制剂沙利度胺对其所具有的抑制作用显示出其对慢性高原病的治疗前景。但Ang-1在慢性高原病患者血清中的变化和对新生血管形成的确切作用，还有待进一步研究。

　　【参考文献】

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　　[4] 杜彬，周序珑. 血管生成素的特点及其血管新生的调节作用[J]. 中国病理生理杂志, 2003, 19(2)：275-278

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　　[11] D'Amato RJ, Loughman MS, Flynn E, et al. Thalidomide is an inhibitor of angiogenesis[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1994, 91: 4082-4085

　　[12] Li X, Liu X, Wang J, et al. Thalidomide down-regulates the expression of VEGF and bFGF in cisplatin-resistant human lung carcinoma cells[J]. Anticancer Res. 2003, 23: 2481-2487

　　[13] Marriott JB, Clarke IA, Czajka A, et al. A Novel Subclass of Thalidomide Analogue with Anti-Solid Tumor Activity in Which Caspase-dependent Apoptosis is Associated with Altered Expression of bcl-2 Family Proteins[J]. Clin Cancer Res. 2005, 11(16):5984-5992