阿魏酸钠对大鼠肾脏缺血再灌注损伤的作用

　　作者：孙晶 顾华 吴曼 罗丛娟 黄凤霞 许钟镐 苗里宁 作者单位：吉林大学第二医院肾病内科，吉林 长春 130041 南京军区南京总医院血液净化中心

　　【摘要】 目的 建立大鼠肾脏缺血再灌注损伤(IRI)模型，观察阿魏酸钠(SF)对大鼠肾脏是否具有保护作用，并初步探讨其机制。方法 32只雄性Wistar大鼠，随机分为4组:①正常组，②假手术组，③模型组，④治疗组，测定各组血清肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)及肾脏组织中丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)水平，观察肾功能变化、组织过氧化情况及机体抗氧化能力;光镜下观察肾脏组织形态学变化。结果 模型组各项指标与假手术组相比有显著差异，说明模型制作成功。同时治疗组可明显降低SCr、BUN及MDA含量，并升高SOD水平，与模型组相比有显著性差异，而且肾脏组织的病理改变减轻。结论 SF对大鼠肾脏IRI有保护作用，其机制可能与对抗自由基、抗脂质过氧化等作用有关。

　　【关键词】 肾;缺血再灌注损伤;阿魏酸钠

　　目前已经有大量的研究表明阿魏酸钠(SF)对肾脏有明显的保护作用，而且临床应用也比较多，尤其对于糖尿病肾病(DN)的肾脏保护作用，更是近年来国内外研究的热点且已被研究证实〔1，2〕。同时其对心肌缺血再灌注损伤(Ischemia-reperfusion injury，IRI)的保护作用也已逐渐被认可〔3〕，但是关于其在肾脏IRI方面的研究目前还很少。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 实验动物与分组

　　清洁级雄性Wistar大鼠32只，体重200～250 g，购于吉林大学第二医院动物中心，自由进食、水。

　　1.1.2 主要药品与试剂

　　科强SF注射液(吉林西点药业提供);尿素氮(BUN)测定试剂盒及血清肌酐(SCr)测定试剂盒(北京北化康泰临床试剂有限公司);丙二醛(MDA)测定试剂盒、超氧化物歧化酶(SOD)及考马斯亮蓝法蛋白测定试剂盒(江苏南京建成生物工程研究所)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 肾脏IRI模型制备

　　术前禁食6 h并于术前称重，腹腔注射氯胺酮麻醉(2 ml/kg)。将大鼠仰卧固定于操作台上，腹部备皮，75%酒精消毒，暴露手术区域。取上腹部正中切口，自剑突下起，约长5 cm，打开腹腔。用生理盐水浸湿的无菌纱布牵开腹腔脏器，暴露右肾，钝性分离右肾肾蒂，以3-0幕丝线双道结扎右肾蒂;同样暴露并钝性分离左肾肾蒂。以无创伤血管夹夹闭左肾动静脉，并开始计时，观察左肾颜色：由红润变为苍白表示夹闭有效。45 min后移去血管夹，观察肾脏颜色：恢复红润，提示再灌注良好。以3-0幕丝线逐层关闭腹膜、腹白线和皮肤，用75%酒精消毒伤口，待完全苏醒放回饲养笼中。

　　1.2.2 动物分组

　　将Wistar大鼠随机分为4组，每组8只，分别行以下处理：①正常组：仅给予110 mg·kg-1·d-1的生理盐水灌胃7 d，不作手术;②假手术组：给予110 mg·kg-1·d-1的生理盐水灌胃7 d后，做肾脏IRI模型，手术仅暴露肾脏45 min，不阻断肾蒂;③模型组：给予110 mg·kg-1·d-1的生理盐水灌胃7 d，再做肾脏IRI手术模型;④治疗组：给予阿魏酸钠110 mg·kg-1·d-1灌胃7 d，再建立大鼠肾脏IRI模型。各组均于再灌注24 h后留取标本、处死。

　　1.2.3 标本采集

　　腹腔注射氯胺酮(2 ml/kg)麻醉大鼠，从心脏抽血2 ml注入试管中，将试管置于离心机内，1 500 r/min离心5 min，留取血清。随后迅速开腹腔，留取肾组织，将肾组织一部分置于-70℃冰箱中储存，用于氧化指标的测定，其余部分迅速浸入10%的福尔马林固定液中。

　　1.2.4 血生化的测定

　　血清标本采用检测试剂盒在本科实验室自行检测BUN、SCr。具体操作按试剂盒说明进行，比色法测定含量。

　　1.2.5 肾组织SOD、MDA测定

　　1.2.5.1 组织匀浆制备 测定时样品于低温环境下称重，置于含有冷生理盐水的离心管中(离心管放在冰水中)。用超声波细胞粉碎机制成10%的组织匀浆液。将肾组织匀浆用低温离心机以3 500 r/min离心10～15 min，取适量上清液用于SOD活性和MDA含量的测定。

　　1.2.5.2 SOD测定

　　黄嘌呤氧化酶法测定SOD的活力。测定原理：通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子自由基，后者氧化羟胺形成亚硝酸盐，在显色剂的作用下呈现紫红色，用可见光分光光度计测定其吸光度，通过公式计算出被测样品中的SOD活性。

　　1.2.5.3 MDA测定

　　按试剂盒说明书操作。测定原理：过氧化脂质的分解产物MDA在醋酸酸性条件下加热，与硫代巴比妥酸反应生成红色产物，在532 nm处有最大吸收峰。用分光光度计测定其吸光度。通过公式求出被测样品MDA含量。

　　1.2.6 病理染色

　　取肾皮质用10%的福尔马林固定，经过常规酒精脱水、二甲苯透明，然后进行浸蜡、包埋，制成2 μm厚切片，进行HE染色、PAS染色。①HE染色：常规石蜡切片脱蜡至水，苏木素染色5 min，自来水冲洗，1%盐酸酒精分化5 s，再用自来水充分洗涤，1%氨水返蓝数秒，1%伊红染色3 min，自来水冲洗，酒精梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。②PAS染色：常规石蜡切片脱蜡至水，1%过碘酸染色15 min，蒸馏水冲洗，Schif试剂反应30 min，0.5%亚硫酸钠处理2 min共3次，流水洗5～10 min，苏木素复染5 min，自来水冲洗，1%盐酸酒精分化数秒，再用自来水冲洗，酒精梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

　　1.3 统计学处理

　　采用SPSS11.0进行统计学分析。计量资料采用x±s表示，多组间计量资料比较采用单因素方差分析，两组间比较采用t检验。

　　2 结 果

　　2.1 SF对肾IRI肾功能的影响

　　正常组与假手术组比较无显著性差异;模型组及治疗组与正常组及假手术组相比BUN、SCr水平均明显上升，有显著性差异(P<0.01);治疗组与模型组相比BUN、SCr水平明显下降，有显著性差异(P<0.01)。见表1。表1 SF对肾IRI肾功能的影响(略)

　　2.2 SF对肾IRI组织氧化指标的影响

　　假手术组SOD、MDA含量与正常组比较无显著性差异;假手术组与模型组相比SOD含量明显减少、MDA含量明显增加，有显著性差异(P<0.01);治疗组与模型组相比SOD含量明显增加、MDA含量明显减少，有显著性差异(P<0.01)。见表2。表2 各组大鼠肾组织氧化指标变化(略)

　　2.3 SF对肾IRI组织病理学的影响

　　各组大鼠肾脏外观及颜色基本正常，正常组及假手术组大鼠HE切片未见明显的形态学改变。模型组肾脏微肿胀、颜色稍暗，切开见皮髓分界欠清，镜下主要为肾间质改变，可见明显的肾小管上皮细胞水肿、空泡变性、基底膜皱缩、刷状缘消失、核碎裂等;治疗组上述病理改变虽然没有恢复正常，但是较模型组明显减轻。见图1。

　　3 讨 论

　　IRI的概念由Jenning于1960年首次提出，指缺血组织或器官重获血流灌注或氧供应后，对组织或者器官所产生的损伤作用〔4〕。肾脏是人体中容易受到缺血以及IRI的器官之一。肾脏IRI是急性肾衰竭的常见原因，也是肾脏移植术后影响移植物早期功能恢复和移植物长期存活的主要因素之一〔5，6〕。肾脏IRI是由多因素、多途径，多方面介导的复杂过程。再灌注时组织内氧自由基(O2)等自由基大量增加，O2具有极强的氧化活性。在正常情况下，O2可以被内源性自由基清除剂如SOD、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、抗氧化剂谷胱甘肽(GSH)和维生素等清除，但当组织细胞缺血缺氧时，氧自由基清除系统功能降低或丧失，而生成系统却活性增强，一旦恢复组织血液供应和氧供，O2便大量产生与急剧“堆积”，以不同方式造成细胞急性或慢性损伤〔7〕。

　　本实验采用无损伤动脉夹夹闭大鼠肾蒂45 min后再灌注，导致血清BUN，SCr含量与假手术对照组相比明显增高，且血清BUN，SCr测定值于再灌注后较单纯缺血时明显增高。BUN及SCr是机体代谢产生的非蛋白含氮化合物，主要经肾排泄，而其血清含量增高是由于肾缺血再灌注时肾小球及肾小管上皮细胞损伤，导致肾小球滤过率下降，BUN及SCr不能顺利排出，证实已造成肾急性IRI。

　　SF即3-甲氧基-4-羟基-苯丙烯酸钠，是阿魏酸(Ferulic Acid，FA )(4-羟基-3-甲氧基肉桂酸)的钠盐，FA普遍存在于当归、川芎、蜂胶、酸仁枣等中药材中，属酚酸类化合物。结构中有酚羟基，具抗氧化活性，但在空气中不稳定，故临床常应用其钠盐。SF被证明是一种新的非肽类内皮素受体拮抗剂(E-TRA)〔8，9〕，可拮抗内皮素引起的血管收缩、升压及血管平滑肌细胞增殖;抑制血管收缩物质血栓素A2(TXA2)，增加一氧化氮(NO)的合成，松弛血管平滑肌;抑制血小板聚集、抗凝血、改善血液流变学特征;具有抗氧化和自由基清除作用;有免疫调节作用，能阻止活化补体引起的中性粒细胞聚集，对补体激活引起的器官损伤有一定保护作用;还有抗炎作用，可以降低毛细血管通透性。

　　近年来大量的研究证明SF在DN的治疗方面有着巨大的作用。杨福燕〔10〕等在常规治疗基础上加用SF治疗DN，结果内皮素(ET)水平和尿白蛋白排泄率(UAER)明显下降，而常规治疗组UAER明显下降，ET水平无显著变化。赖基贤〔11〕等亦报道常规治疗加SF对DN临床蛋白尿期患者能良好地控制血压，减少蛋白尿，降低SCr、BUN。赵同峰等〔12〕观察了SF对糖尿病大鼠肾脏抗氧化酶的影响，发现经SF治疗的糖尿病大鼠肾脏和血清的SOD及CAT的活性显著升高，MDA显著降低。 说明SF是一种较好的抗氧化剂，可有效保护SOD、CAT 的活性，抑制脂质过氧化反应。本试验通过建立大鼠肾脏IRI模型，检测SOD、MDA，治疗组与模型组比较有显著差异，证明SF的抗氧化活性在肾脏IRI方面同样有保护作用，与上述实验研究结果相符。

　　本试验术前1 w每天给予大鼠SF灌胃1次，术后24 h处死，结果显示治疗组能明显降低大鼠BUN、SCr，虽未降至假手术组及正常组的指标，但是与模型组比较有显著差异。同时治疗组MDA的含量明显降低，SOD的含量明显升高，由此推测SF可能通过抗O2来减轻肾脏IRI，保护肾脏。

　　目前多数学者认为SF可能是通过下述机制对IRI发挥保护作用：①抑制IRI时自由基的产生，抑制脂质过氧化反应，减轻膜结构的损伤;②保护细胞中抗氧化酶的结构，提高抗氧化酶活性，使自由基及时清除;③抑制红细胞、血小板聚集，有利于血管再通，改善组织缺氧，减轻组织损伤。本实验结果表明，SF也能明显降低肾IRI时血清BUN、SCr含量，减轻肾组织损害。同时，治疗组肾组织线粒体中SOD活性明显高于模型组，而MDA含量明显低于模型组。说明SF抗肾IRI的机制与其在其他组织中抗IRI的作用机制一样，均能提高IRI组织的SOD等抗氧化酶活性，抑制自由基的产生，降低活性氧簇(ROS)水平，抑制脂质过氧化，对肾脏起到保护作用。本实验仅就SF对肾IRI的保护机制进行了初步探讨，深入研究正在进行中。

　　【参考文献】

　　1 Zhao TF，Zhang L，Deng HC.Renal protective effect and its mechanism of sodium ferulate in diabetic rats〔J〕.Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi，2004;24(5):445-9.

　　2 Fujita A，Sasaki H，Doi A,et al.Ferulic acid prevents pathological and functional abnormalities of the kidney in Otsuka Long-Evans Tokushima Fatty diabetic rats〔J〕.Diabetes Res Clin Pract，2008;79(1):11-7.

　　3 刘季春，万 力，邵立建，等.阿魏酸钠对离体大鼠心脏的药理性预适应保护作用及机制〔J〕.中国药理学通报，2007;23(5):618-22.

　　4 郑华军，刘玉衫，闵志廉.肾脏缺血再灌注损伤的基因表达变化的进展〔J〕.中华器官移植杂志，2001;22(2):119-21.

　　5 Giral-Classe M，Hourmant M，Cantarovich F,et al.Contribution of prolonged ischemia and donor age to chronic renal allograft dysfunction〔J〕. J Am Soc Nephrol，2000;11：1317-24.

　　6 Tullius SG，Nieminen-kelh++-M，Buelow R，et al.Inhibition of ischemia/reperfusion injury and chronic graft deterioration by a single-donor treatment with cobalt-protoporphyrin for the induction of heme oxygenase-1〔J〕.Transplantation，2002;74(5)：591-8.

　　7 Ruiz-Gines JA,Lopez-Ongil S,Gonzalez-Rubio M,et al.Reactive oxygen species induce proliferation of bovine aortic endothelial cells〔J〕. J Cardiovasc Pharmacol，2000;35(1):109-13.

　　8 王 峰，王京媛，李 菲，等.咖啡酸、阿魏酸和CA-1201拮抗ET1的生物效应〔J〕.中国病理生理杂志，1999;15(8):688-91.

　　9 王 峰，刘 敏，杨连春，等.新的非肽类内皮素拮抗剂:咖啡酸、阿魏酸〔J〕.药学学报,1999;34(11):898-901.

　　10 杨福燕，魏崇一,王凤业,等.阿魏酸钠对糖尿病肾病患者血浆内皮素的影响〔J〕.新乡医学院学报，2003;20(3):199-200.

　　11 赖基贤，江文庆,林丽芬,等.阿魏酸钠对临床糖尿病肾病期病情进展影响的观察〔J〕.临床医学，2003;23(9):29-30.

　　12 赵同峰，邓华聪.阿魏酸钠的药理研究新进展〔J〕.西北药学杂志，2001;16(3):135-6.