程序化细胞死亡分子5蛋白对地塞米松诱导的多发性骨髓瘤细胞凋亡的影响

　　作者：刘竞 李昕 桂嵘 蒋铁斌 王二华 作者单位：中南大学湘雅三医院血液科，湖南 长沙 410013

　　【摘要】 目的 观测程序化细胞死亡分子5(PDCD5)蛋白表达对地塞米松(DXM)诱导人多发性骨髓瘤(MM)细胞株(KM3)凋亡的影响。方法 将不同浓度的rhPDCD5蛋白单独或与DXM同时加入处于对数生长期的KM3细胞株中培养16 h后，通过普通倒置显微镜和DAPI染色后荧光显微镜观察KM3细胞的形态变化，应用膜联蛋白V(Annexin V)和碘化丙啶(PI)标记后进行流式细胞仪(FCM)检测KM3细胞凋亡率。结果 PDCD5蛋白与DXM联用组可观察到多数细胞皱缩、胞膜发泡及不规则凹陷，核固缩、核分裂等凋亡相关的形态学改变;单用组PDCD5蛋白或DXM组可观察到部分细胞凋亡形态学改变，但不如联用组明显;PBS对照组细胞形态则无明显变化。联用组其KM3细胞凋亡率较单用组明显增加，且浓度较高PDCD5蛋白组其凋亡率更高。结论 rhPDCD5蛋白可直接作用于KM3使其凋亡，并对DXM诱导的KM3细胞凋亡有明显的促进作用。

　　【关键词】 程序化细胞死亡分子5;地塞米松;多发性骨髓瘤;细胞凋亡

　　Effect of human recombinant PDCD5 protein on cell apoptosis of KM3 multiple myeloma cells induced by dexamethasone

　　LIU Jing, LI Xin, GUI Rong, et al.

　　Department of Hematology, the Third Xiangya Hospital, Central South University, Changsha 410013, Hunan, China

　　【Abstract】 Objective To observe the effect of PDCD5 protein on the apoptosis of multiple myeloma (MM) KM3 cells induced by dexamethasone. Methods The rhPDCD5 protein were added alone of different concentrations or conjuncted with dexamethasone to KM3 cells in phase of logarithmic growth and cultured for 16 h, then the cells were collected after coculture for the following experiments. Cell morphology was observed by inverted microscope directly and by fluorescence microscope after staining with DAPI. Effects of rhPDCD5 protein and dexamethasone on the apoptotic rate of KM3 cells were detected by Annexin VFITC and PI double staining. Results Cell shrinkage, membrane protrusions and irregular bubbleshaped depression, nuclear pyknosis, nuclear fission and other morphological characteristic of apoptosis were observed in PDCD5 combined with dexamethasone group, while in singletreatment groups there were some but relatively little morphological changes of apoptosis. PBS control group had no significant changes in cell morphology. Apoptotic rate increased more obviously in the combination groups than in the singletreatment groups. Conclusions rhPDCD5 protein can enter MM cells KM3, induce apoptosis of KM3 cells and accelerate apoptosis of KM3 cells induced by dexamethasone.

　　【Key words】 PDCD5; Dexamethasone; Multiple myeloma; Apoptosis

　　近年研究表明细胞凋亡紊乱在多发性骨髓瘤(MM)的发病机制中起重要作用，为其发病机制的探讨提供了依据〔1〕。程序化细胞死亡分子5(PDCD5)是一个凋亡相关的人类基因〔2〕。在前期开展PDCD5在MM中的表达及其与Bcl2相关性研究〔3〕发现，MM患者骨髓单个核细胞PDCD5蛋白和mRNA表达下调，Bcl2蛋白和mRNA表达上调，PDCD5与Bcl2蛋白阳性细胞率和mRNA表达均呈负相关。单用PDCD5蛋白也许不能诱导MM细胞发生凋亡，而地塞米松(DXM)作为糖皮质激素的一种衍生物，是公认的可诱导MM细胞发生凋亡的一种药物。因此本文将rhPDCD5蛋白与DXM联用，观察PDCD5蛋白表达在体外是否可以促进MM细胞的凋亡。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　KM3细胞为普通MM病人细胞株，由中南大学分子生物学实验室馈赠。主要试剂：重组人PDCD5(rhPDCD5)蛋白，购自北京宝赛公司;DAPI染料购自德国 AppliChem公司，膜联蛋白V(AnnexinV)异硫氰酸荧光素(FITC)和碘化丙啶(PI)凋亡检测试剂盒，购自美国ADL公司。主要仪器： 倒置显微镜及多功能照相光学显微镜，日本Olympus公司;荧光显微镜，德国Zeiss公司产品;EPICS ALTRA流式细胞仪，美国贝克曼库尔特有限公司。

　　1.2 细胞培养

　　在洁净工作台中吸取KM3细胞于培养瓶中，培养于含15%新生牛血清的RPMI 1640培养基中，在37℃，5%CO2恒温培养箱中培养，根据细胞生长情况，平均每隔2天换液并传代1次。待细胞生长良好，处于对数生长期，并达数目要求后进行不同药物浓度的干预。

　　1.3 实验分组

　　实验选用对数生长期的细胞分实验组和对照组：实验组分别加入终浓度〔4〕10、20 mg/L的rhPDCD5蛋白和/或8 mg/L的DXM〔5〕，分成5组：10、20 mg/L PDCD5蛋白组、8 mg/L DXM组、10 mg/L PDCD5蛋白+8 mg/L DXM组、20 mg/L PDCD5蛋白+8 mg/L DXM组;对照组加入等体积的PBS液，以上各孔细胞浓度均调整为5×105/ml，相同条件下培养16 h。

　　1.4 细胞形态学观察

　　实验组及对照组在干预16 h后于普通倒置显微镜下观察细胞形态变化，DAPI染色，荧光显微镜下观察细胞的形态并拍照。

　　1.5 流式细胞仪分析

　　分别将实验组及对照组处理16 h后的KM3悬浮细胞收集到10 ml离心管中，在室温下以500 r/min离心5 min，弃培养液。用预冷1×PBS(4℃)50 μl重悬细胞一次，500 r/min离心5 min，洗涤细胞。用灭菌去离子水稀释10倍Buffer至1倍Buffer，按每个标本400 μl的1倍Buffer的量配制，置于冰上备用。标记液配制：每份标本(105～106细胞)配制Annexin V标记液100 μl，分别是10倍Buffer 10 μl、Annexin VFITC 5 μl、蒸馏水85 μl。用标记液轻轻重悬细胞，105～106细胞/100 μl孵育液，在暗处，室温下孵育15 min，再在每份标本中加入10 μl PI。每100 μl孵育液中加入冷400 μl 1倍Buffer稀释，15 min内进行流式检测。重复3次独立实验结果进行统计。

　　1.6 统计学方法

　　应用SPSS13.0统计分析软件处理，实验数据均以x±s表示，组间比较采用单因素方差分析。

　　2 结 果

　　2.1 细胞形态学观察

　　2.1.1 普通光镜下观察细胞形态

　　PBS对照组细胞在普通倒置光学显微镜下观察大小较为一致，形态基本正常，折光性好;rhPDCD5蛋白组、DXM组细胞折光性略有减弱，部分细胞出现体积变小，变形、皱缩，细胞膜完整但出现发泡现象，染色体浓集等凋亡相关形态学改变;PDCD5蛋白+ DXM组可观察到多数细胞变形皱缩，边缘发泡明显，折光性减弱等凋亡相关形态学改变。见图1。

　　2.1.2 荧光显微镜下观察DAPI染色后细胞形态

　　单用PDCD5蛋白、DXM培养16 h后，细胞在荧光显微镜下观察到部分细胞呈现核浓缩、染色加深的凋亡相关形态学改变;PDCD5蛋白+ DXM组可观察到多数细胞呈现核浓缩、染色加深、核染图1 普通倒置显微镜下观察各组未染色KM3细胞形态(×250)色质呈新月形聚集于核膜一边;或者表现为核碎裂成大小不等的圆形小体的凋亡相关形态学变化。PBS对照组细胞核形态无明显变化。见图2。

　　2.2 FCM分析细胞凋亡率

　　PBS对照组凋亡率为(11.83±0.80)%，单用10 mg/L PDCD5蛋白组凋亡率为(20.99±0.66)%，单用20 mg/L PDCD5蛋白组凋亡率为(32.94±0.16)%，单用DXM(8 mg/L)组凋亡率为(39.78±1.18)%;10 mg/L PDCD5蛋白与DXM联用凋亡率为(52.05±0.68)%，20 mg/L PDCD5蛋白与DXM联用凋亡率为(77.88±0.68)%。各组间差异有显著性(P<0.05)。

　　3 讨 论

　　凋亡过程的紊乱，可能与许多疾病的发生有直接或间接的关系，如肿瘤、自身免疫性疾病、神经退行性变及局部损伤等。近年来研究发现凋亡的调节机制对于弄清肿瘤的发病机制及提供新的肿瘤防治措施具有重要的意义。而MM的发病与凋亡过程的紊乱更是有着非常紧密的联系〔6〕。

　　PDCD5基因是一个重要的凋亡相关基因，表达于细胞核，其真核表达载体可导致白血病细胞株TF1细胞加速凋亡，采用反义封闭和抗体封闭实验均显示内源性的PDCD5在细胞凋亡过程中发挥重要的正调控效应〔7〕。研究显示PDCD5在多种肿瘤组织中均表达下降〔2〕，而在前期的研究中亦发现PDCD5在MM患者的单个核细胞中的mRNA水平和蛋白水平均表达明显降低，进一步提示PDCD5与MM的发病存在密切的联系。研究显示PDCD5 是凋亡促进剂，而不是凋亡诱导剂〔8〕。因此本实验选用明确具有诱导细胞凋亡作用而且是MM化疗经典方案的重要组成部分的糖皮质激素类药物DXM为凋亡诱导剂。本实验结果提示，DXM是MM细胞的凋亡诱导剂，其单用可以诱导MM细胞的凋亡，但其凋亡率不高，而加用PDCD5蛋白后，可以明显提高DXM对MM的诱导凋亡作用，提示PDCD5对于MM细胞有一定的促进凋亡作用。较高浓度PDCD5蛋白(20 mg/L)较浓度较低PDCD蛋白(10 mg/L)作用更明显。

　　【参考文献】

　　1 Oancea M，Mani A，Hussein MA,et al.Apoptosis of multiple myeloma〔J〕. Int J Hematol，2004;80(3):22431.

　　2 马大龙.新细胞因子及细胞凋亡基因的发现与功能研究〔J〕.北京大学学报(医学版)，2002;34(5):48892.

　　3 蒋铁斌，李 昕，周 俊，等.PDCD5在多发性骨髓瘤中的表达及其与BCL2相关性〔J〕.中南大学学报(医学版)，2008;33(9):81420.

　　4 陶 莹，李登清，漆 涌，等.重组促凋亡蛋白TFAR19对CNE1细胞凋亡影响的初步研究〔J〕.实用预防医学，2006;13(2):2223.

　　5 何 莉，刘云鹏，侯科佐.MAPK信号转导系统在地塞米松诱导的CEM细胞增殖及凋亡中的作用〔J〕.现代肿瘤医学，2008;16(10):16569.

　　6 Xiao H，Xiao Q，Zhang K,et al.Reversal of multidrug resistance by curcumin through FA/BRCA pathway in multiple myeloma cell line MOLP2/R〔J〕.Ann Hematol，2010;89(4)：399404.

　　7 阮国瑞，陈珊珊，常 艳，等.凋亡促进分子TFAR19在成人慢性髓性白血病骨髓细胞的异常表达〔J〕.北京大学学报(医学版)，2002;34(6):6769.

　　8 张颖妹，徐秀珍，刘红涛，等.人重组TFAR19蛋白对白血病细胞株HL60的促凋亡效应〔J〕.中国免疫学杂志，2000;16(1):811.