ADAMTS13活性及抑制物测定在ITTP诊断中的价值

　　作者：秦燕，苏 健，黄石兵，刘 红 作者单位：(1南通大学附属医院血液科，南通 226001; 2苏州大学附属第一医院江苏省血液病研究所)

　　【摘要】 目的:建立血管性血友病因子裂解蛋白酶(ADAMTS13)活性及其抑制物测定方法，研究其在原发性血栓性血小板减少性紫癜(ITTP)患者中的表达情况，鉴别出免疫介导性获得性TTP，为临床免疫抑制治疗提供实验室依据。方法:用残余胶原结合试验(R-CBA)检测患者血浆标本ADAMTS13活性及其抑制物试验。结果:20例ITTP患者中18例ADAMTS13活性低于10%，与正常对照组比较，差异有统计学意义(P<0.01);其中15例抑制物试验结果阳性。结论:ITTP患者ADAMTS13活性极度减低或缺乏，且多数检测出ADAMTS13抑制物，通过抑制物试验，方便鉴别出免疫介导性获得性TTP患者，为临床进一步联合免疫抑制剂治疗提供依据。

　　【关键词】 血栓性血小板减少性紫癜; 血管性血友病因子裂解蛋白酶;残余胶原结合试验; 免疫介导性

　　The value of the determination of the ADAMTSl3 activity and its inhibitor in ITTP patients

　　QIN Yan1,SU Jian2,HUANG Shibing1,et al (1Department of Hematology, Affiliated Hospital of Nantong University, Nantong 226001;2Jiangsu Institute of Hematology)

　　[Abstract] Objective: To establish the testing methods for von Willebrand factor cleaving protease (ADAMTS13) activity and its inhibitor, investigate the expression of ADAMTS13 in patients with primary thrombotic thrombocytopenic purpura and identify the immune mediated acquired TTP, which would provide the basis for the clinical immunosuppressive therapy. Methods: The activity and inhibitor of ADAMTS13 in the plasma samples of 20 ITTP cases were detected by the residual collagen binding assay (R-CBA). Results: The ADAMTS13 activity of 18 cases was less than 10%, compared with the normal group(P<0.01); furthermore, in inhibitor test 15 cases of them were with positive results. Conclusion: ITTP patients have extremely low or even lack of ADAMTSI3 activity, and ADAMTS13 inhibitor is also detected in the plasma from most patients. Inhibitor test makes it easy to identify immune mediated acquired TTP, and provides a basis for clinical immunosuppressive therapy.

　　[Key words] Thrombotic thrombocytopenic purpura; Von Willebrand factor cleaving protease;Residual collagen binding assay; Immune mediated

　　血管性血友病因子裂解酶( von Willebrand factor cleaving protease， vWF-cp) 是新近确定的一种金属蛋白酶,存在于正常人的血浆中。研究表明它是金属蛋白酶域蛋白(ADAMTS)家族中的一个新成员,故命名为ADAMTS13。在流动血浆剪切力作用下， 其作用于血管性血友病因子(vWF) A2区842酪氨酸—843蛋氨酸间的肽键，将vWF多聚体裂解为大小不等的小分子肽段，在生理状态下调控vWF的结构与功能。当ADAMTS13活性降低从而无法切割超大分子量vWF(UL-vWF)时，UL-vWF可网罗血浆中的血小板从而导致微血管内富含血小板血栓形成，此为遗传性(CTTP)和原发性TTP(ITTP)的重要发病机制[1]。多数ITTP患者存在针对ADAMTS13活性的抗体或抑制物[2]。国外已经建立了多种检测ADAMTS13活性水平的方法，分析经ADAMTS13酶解后血浆(清) vWF 的多聚体形式或检测其胶原结合能力是两种常用的方法[3-4]。我们在本室既往工作的基础上, 采用残余胶原结合实验法检测了健康成人血清以及TTP患者ADAMTS13活性，并进行ADAMTS13抑制物检测，实验方法简便、快捷。

　　1 对象与方法

　　1.1 研究对象 临床诊断的ITTP 20例，男3例，女17例，年龄22 ~73岁，平均42岁。中位发作期时血红蛋白47～79 g/L、破碎红细胞3%～7%、乳酸脱氢酶582～1102 U/ml、血小板减少(10～59)×109/L，均具有微血管病性溶血性贫血及神经系统症状。16例体温≥38.5 ℃，尿蛋白和隐血试验阳性18例。尿素氮7.0～14.4 mmol/L，平均9.9 mmol/L。肌酐102～203 μmol/L， 平均为170 μmol/L。Coombs 试验和3P试验均阴性。正常对照26名为献血员。

　　1.2 方法

　　1.2.1 血样采集及保存采集的血样用129.2 mmol/L枸橼酸钠1∶9抗凝，3000 r/min离心10 min。将血浆分装冻存在30 ℃冰箱。

　　取患者血浆及健康对照者血浆分成2份，每份50 μl。1份放入微量透析管内(Slide-A-Lyzer,Pierce公司)，在含0.005 mol/L Tris ，0. 1 % Tween 20，1.5 mol/L 尿素，pH 8.3 的缓冲液中37 ℃透析过夜。另1份血浆在透析期间置室温待用。同时取9份患者血浆与1份正常血浆混匀，37 ℃水浴3 h，取该混匀血浆50 μl同样放入微量透析管内透析过夜。

　　1.2.2 包板 以Ⅲ型胶原(5 μg/ ml) 包被高吸附酶标检测板，200 μl/ 孔，4 ℃湿盒过夜，以TBS-T (0.025 mol/ L Tris，0.05 mol/L NaCl，0.1 %Tween 20，pH7. 4) 洗涤3 遍，2.5 % BSA 于37 ℃封闭2 h。

　　1.2.3 上样 将透析前后的血浆用PBS 20倍稀释，100 μl/ 孔加入酶标板孔中。每份血浆设3个复孔，37 ℃水浴摇床温育60 min。

　　1.2.4 加入抗体 洗板，然后加入兔抗人vWF 多抗(1∶10000稀释) ，温育60 min，再洗涤后加入二抗辣根过氧化物酶标记的羊抗兔-IgG，37 ℃水浴温育60 min。

　　1.2.5 显色 洗板，OPD 显色，测OD490读数。以透析前后的OD490比值作为该份待测血样的残余胶原结合活性(R-CBA) 。以100 %减去R-CBA 作为的ADAMTS13活性水平。患者、正常人混合孵育血浆透析前后ADAMTS13活性水平均缺乏为抑制物阳性。

　　1.2.6 统计学方法 结果数据以x±s表示，两组比较采用t检验，P<0.05示差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 ADAMTS13活性水平 健康对照26例血浆ADAMTS13活性水平为(84.79±12.21)%，范围68.24%～98.0%， ITTP 20例中18例ADAMTS13极度降低(<10%)，该组血浆ADAMTS13活性水平(8.23±17.91)%，范围0%～79.13%，ITTP组ADAMTS13活性水平明显低于健康对照组(P<0.01)。

　　2.2 ADAMTS13抑制物检测 ADAMTS13极度降低的ITTP 18例患者中，检测出ADAMTS13抑制物15例，2例未检测出抑制物的血样进行基因检测未发现ADAMTS13基因突变，从而排除CTTP。

　　3 讨 论

　　多年以来，临床诊断TTP主要依靠微血管病性溶血性贫血、血小板减少、神经系统表现、肾功能异常及发热经典的五联征或仅三联征(前三项表现)，Tsai[5]和Furlan[6]先后鉴定出vWF裂解蛋白酶，其作用是切割UL-vWF以防止产生血管内血小板聚集和血栓形成。2001年Fujikawak[1] 和Gerritsen[7]将该酶纯化、克隆，由于其属于“有凝血酶敏感蛋白1型结果结构(TSP1)基因重复序列的去整合素和金属蛋白酶”家族的新成员，命名为ADAMTS13。ADAMTS13缺乏和ADAMTS13基因突变分别是ITTP和CTTP的分子基础。大部分ITTP ADAMTS13缺乏是由于机体存在抑制物[2]。继发性TTP和HUS ADAMTS13缺乏罕见，据俄罗斯TTP-HUS登记处统计，92例继发性TTP或HUS病例中无1例出现ADAMTS13缺乏[8] 。在排除了血肌酐超过310 μM的血栓性微血管病(TMA)的血样中90%以上出现ADAMTS13活性缺乏[4] 。因此ADAMTS13活性产生缺乏已被视为诊断TTP的特异性标志。

　　通过检测ADAMTS13活性及其抑制物可从ITTP中鉴别出免疫介导性ITTP。ITTP患者多对血浆置换(PE)敏感，PE的分子基础不仅为患者补充了ADAMTS13，而且清除了抑制ADAMTS13活性的抑制物，从而有效缓解病情，并为临床联合应用免疫抑制剂提供实验室依据。

　　本研究共收集20例ITTP患者血浆，利用Slide-A-lyser微量透析管，将患者血浆、正常人血浆以及孵育后的患者正常人混合血浆置于含尿素的缓冲液中透析，尿素能使vWF变性，空间结构舒展，充分暴露其酶切位点，更利于血浆中ADAMTS13充分发挥作用。ITTP患者由于该酶活力缺乏在透析过程中不能裂解长链vWF，R-CBA透析前后无明显变化。由于ITTP患者血浆中存在ADAMTS13抑制物，故即使加入正常人血浆，R-CBA仍无变化，从而提示抑制物阳性，反之若无抑制物，加入正常人血浆后ADAMTS13活性升至正常范围，本研究ADAMTS13抑制物检测方法为国内首次报道。我们的结果表明90%ITTP患者ADAMTS13活性较正常对照极度降低，ADAMTS13缺乏患者中大部分可检测到抑制物。故检测ADAMTS13活性及抑制物将为TTP的诊断、原发性与继发性TTP的鉴别及ITTP的诊断、预后判断具有指导意义。

　　【参考文献】

　　[1] Fujikawa K, Suzuki H, Mcmullen B, et al. Purification of human von Willebrand factor-cleaving protease and its identification as a new member of the metalloproteinase family[J]. Blood,2001，98(9):1662-1666.

　　[2] Zheng XL, Kaufman RM, Goodnough LT,et al. Effect of plasma exchange on plasma ADAMTS13 metalloproteinase activity, inhibitor level, and clinical outcome in patients with idiopathic and nonidiopathic thrombocytopenic purpura[J]. Blood,2004，103(11):4043-4049.

　　[3] Bianehi V，Robles R，Albefio L，et al.Von Willebrand factor-cleaving protease(ADAMTS13) in thrombocytopenic disorders: a severely deficient activity is specific for thrombotic thrombocytopeniec purpura[J].Blood,2002,100(2):710-713.

　　[4] Tsai HM.Is severe deficiency of ADAMTS13 specific for thrombotic thrombocytopenic purpura[J].J Thromb Haemost,2003，1(4):625-631.

　　[5] Tsai HM. Physiologic cleavage of von Willebrand factor by a plasma protease is dependent on its conformation and requires calcium ion[J]. Blood,1996，87(10):4235-4244.

　　[6] Furlan M, Robles R, Solenthaler M, et al. Deficient activity of von Willebrand factor-cleaving protease in chronic relapsing thrombotic thrombocytopenic purpura[J]. Blood, 1997,89(9):3097-3103.

　　[7] Gerritsen HE, Robles R, Lammle B,et al. Partial amino acid sequence of purified von Willebrand factor-cleaving protease[J]. Blood，2001，98(6):1654-1661.

　　[8] Bohm M, Betz C, Miesbach W, et al. The course of ADAMTS-13 activity and inhibitor titre in the treatment of thrombotic thrombocytopenic purpura with plasma exchange and vincristine[J]. Br J Haematol, 2005，129(5):644-652.