慢性高原病患者骨髓组织Survivin 及VEGF表达水平和MVD变化

　　作者：袁霞1 李占全1 柴克霞1 冀林华1 冶俊玲2 郭新建2 作者单位：青海大学附属医院血液科; 2青海大学附属医院病理科)

　　【摘要】 目的 了解Survivin及VEGF在 慢性高原病(CMS)骨髓组织中的表达和MVD的变化，探讨细胞凋亡与血管新生在CMS发生、发展中的作用。方法 应用免疫组织化学SP法检测20例CMS患者(CMS组)及15例长期居住西宁地区健康人(对照组)骨髓组织中Survivin及VEGF的表达情况和MVD的变化(用CD34单抗标记的血管计数法)并进行比较分析。结果 CMS组Survivin及VEGF阳性表达率分别为70%、75%，均显著高于对照组(分别为26.67%及33.33%，P值均<0.05);CMS组MVD为31.93±6.13，也明显高于对照组(24.94±6.18)，P<0.01。CMS组Survivin阳性表达率、VEGF阳性表达率、MVD及Hb相互间均呈显著正相关(均为P<0.01)。结论 CMS骨髓组织中Survivin和VEGF表达升高, MVD增加，提示Survivin可能通过抑制细胞凋亡，与VEGF协同促进血管生成和红细胞增殖，参与CMS的发生发展。 袁霞(1976～)，女，汉族，青海籍，主治医师，硕士

　　【关键词】 凋亡抑制蛋白 血管内皮生长因子 微血管密度

　　THE STUDY ON THE EXPERSSIONS OF SURVIVINVEGF AND THE MVD IN BONE MARROW OF PATIENTSWITH CHRONIC MOUNTAIN SICKNESSYuan Xia1 ,Li Zhanquan1,Chai Kexia1, Ji Linhua1，Ye JunLin2,Guo XinJian2(1.Department of Hematology, Qinghai University Affiliated Hospital;2. Department of Pathology, Qinghai University Affiliated Hospital)Abstract Objective To explore the pathological roles of apoptosis and angiogenesis in the progenesis and progress of chronic mountain sickness(CMS) by evaluating the expressions of survivin and VEGF and the change of microvessel density(MVD) in bone marrow of patients with CMS. Methods The samples of bone marrow used in this study were obtained from 20 patients with CMS (CMS group) and 15 healthy adults (control group).The expressions of survivin and VEGF in bone marrows were detected using the SP immunohistochemistry technique and the MVD in bone marrow was measured by counting the vascular endothelial cells labeled by anti-CD34 monoclonal antibody. The results were analyzed comparatively .Results The positive rates of survivin and VEGF in CMS group were 70% and 75%,while 26.67% and 33.33% in control group. There were significant differences in the positive rates of survivin and VEGF between these two groups, respectively(P<0.05). MVD in CMS group (31.93±6.13) was significantly higher than that in control group (24.94±6.18 ) (P<0.01) .In the CMS group, there were positive correlations in the positive rates of surviving, VEGF ,MVD and Hb each other (all P<0.01) .Conclusion The results of this study shows that there are over expressions of surviving, VEGF, and the MVD increased in bone marrow of CMS. It is suggested that the survivin and VEGF may play a crucial role in generation and progression of CMS through contributing to the angiogenesis and the erythrocyte proliferation in CMS.

　　Key words Survivin Vascular endothelial growth factor Microvessel density

　　高原人群中的少数个体因对高原环境失去习服而发生慢性高原病(chronic mountain sickness，CMS)。其病变以红细胞过度增生和严重低氧血症为特征，部分病人伴有一定程度的肺动脉高压。发病机理非常复杂，涉及红细胞增殖、分化、凋亡等环节，迄今尚不完全清楚。长期以来，国内外学者对CMS进行了广泛研究，其内容涉及形态学、代谢、造血细胞因子、细胞凋亡、缺氧诱导因子、凝血系统及血管新生等诸多方面。近年来细胞凋亡和血管新生在疾病中的作用愈来愈受到重视。凋亡抑制蛋白 (Survivin)作为凋亡抑制蛋白(IAP)家族的新成员，参与细胞周期及细胞凋亡和增殖平衡的调控、血管生成等病理生理过程。血管形成过程的核心是血管内皮细胞的增殖。血管内皮生长因子 (VEGF)是作用于血管内皮细胞的特异性有丝分裂原,通过旁分泌的方式与其受体VEGFR-1(flt-1)和VEGFR-2(KDR/flk-1)结合后，活化磷脂酞肌醇3激酶(phosphatidylinositol3-kinase,PI3K),促进内皮细胞的增殖和血管形成。CD34是一种分子量为105～120KD的单链穿膜蛋白,表达于早期淋巴造血干细胞、祖细胞、血管内皮细胞、胚胎纤维母细胞和某些神经组织细胞,现多用于标记血管内皮细胞。本实验采用免疫组织化学方法,选用CD34单抗标记血管内皮细胞用以测定微血管密度(MVD)，并联合检测Survivin和VEGF在CMS骨髓组织中的表达情况,分析Survivin、VEGF、MVD之间以及与Hb间的相关性,旨在探讨细胞凋亡相关因子及血管新生在CMS发生发展过程中的作用,为临床评估CMS的发展和预后提供重要的基础理论依据,并为CMS的临床干预提供新靶点。

　　1 材料与方法

　　1.1 研究对象

　　20例CMS患者为我院2007至2008年门诊及住院病人(CMS组)，均为男性，平均年龄40.8±8.42岁，按第六届国际高原医学和低氧生理学术大会制订的慢性高原病诊断标准确诊[1]。以15名西宁地区(海拔2260m)世居男性健康志愿者作为对照组，平均年龄39.27±10.46岁。所有研究对象均进行血常规、尿常规、心电图、X线胸透、肝功能及B超检查,排除各种急、慢性感染及原发性心、肺、肝、肾疾患和其他严重疾病。两组间年龄无统计学意义(P>0.05)。

　　1.2 标本采集及处理

　　1.2.1 外周血采集及处理：采集空腹静脉血5ml注入含有枸橼酸钠的试管中充分混匀,行血细胞分析。

　　1.2.2 骨髓组织的采集及处理：所有患者均行骨髓活检术。骨髓标本均经过10%甲醛溶液固定,脱钙，石蜡包埋。

　　1.3 检测方法

　　Survivin及VEGF应用免疫组织化学SP法检测，MVD通过计数CD34单抗标记的血管内皮细胞检测。免疫组化是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来对组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)进行定位、定性及定量的研究。所应用的主要试剂包括：即用型兔抗人Survivin免疫组化单克隆抗体，即用型鼠抗人VEGF免疫组化单克隆抗体，即用型鼠抗人CD34免疫组化单克隆抗体，即用型SP免疫组化染色试剂盒，即用型DAB试剂盒均购自福建迈新生物技术开发有限公司。所有标本行4 μm厚连续切片。切片常规脱蜡行Survivin、VEGF和CD34的免疫组织化学SP染色。

　　1.4 结果判定标准

　　所有染色切片均由两位富有经验的病理医生在同一条件下用Olympus光学显微镜采用双盲法阅片。

　　1.4.1 Survivin和VEGF染色结果判定标准：Survivin及 VEGF蛋白阳性表达为棕黄色颗粒,主要存在于细胞胞浆。为精确判断蛋白的表达程度及减少假阳性率,记分标准参照许良中等[2]的方法,随机选择10个高倍视野共记录1000个细胞,根据细胞浆的着色程度及着色细胞的百分率进行评分计算阳性系数：基本不着色者为0分,着色淡者为1分,着色适中者为2分,着色深者为3分。着色细胞占计数细胞百分率≤5%者为0分, 6% ～25%者为1分, 26%～50%者为2分, ≥51%者为3分。将每张切片着色程度得分与着色细胞百分率得分各自相乘,即为阳性系数。阳性系数为0、1分者为(-),2、3分者为(+),4、6分者为(++),9分者为(+++)。

　　1.4.2 CD34结果及MVD判定标准：采用抗CD34单克隆抗体标记血管内皮细胞，CD34定位于血管内皮细胞胞膜，棕染。计数MVD，由此来衡量血管生成的活跃程度。参照Weidner法[3]先在低倍镜(×100)下选取组织微血管数量最丰富的区域，然后在高倍镜(×400)视野范围计算3个视野血管的数目，取其平均值作为MVD。微血管判断不以红细胞的出现来确定是否是血管，也不以是否出现管腔来计数血管，凡染色呈棕色的单个内皮细胞或内皮细胞簇，只要它们和邻近的微血管或其他结缔组织分开，就视为一个微血管，只要结构不相连，其分支结构也作为一个血管计数。凡管腔大于8个红细胞大小、带有较厚肌层的血管均不计数。同法顺序计数多个高倍视野，取平均值，最终结果表示为每高倍视野平均微血管数。两人计数相差10%以上者重新计数。

　　1.5 统计分析

　　Survivin及 VEGF检测结果以阳性率表示，MVD值以均数士标准差(x±S)表示。所有结果均应用统计软件SPSS16.0进行处理,Survivin和VEGF的阳性表达率比较采用Fisher精确概率分析, MVD比较采用独立样本t检验 ，Survivin阳性表达率、 VEGF阳性表达率 、MVD及Hb相互之间的相关性采用Spearman相关分析。

　　2 结果

　　2.1 研究对象一般资料(表1)表1研究对象一般资料

　　2.2 骨髓组织中Survivin及VEGF的表达和MVD检测结果

　　Survivin在CMS组14例表达呈阳性(70%)，对照组 4例表达呈阳性(26.67%)，两组间差异具有显著性(P<0.05)(见图1～2)。VEGF在CMS组15例表达呈阳性(75%)，对照组5例表达呈阳性(33.33%)，两组间相比差异具有显著性(P<0.05)，见图3～4。CMS组 MVD为31.93±6.13，明显高于对照组(24.94±6.18，P<0.01)(见图5～6),见表2。表2骨髓组织中Survivin及VEGF的表达和MVD检测结果

　　2.2 CMS骨髓组织中, Survivin、VEGF、 MVD及Hb相互之间的相关性

　　CMS组Survivin阳性表达率、VEGF阳性表达率、MVD及Hb相互间均呈显著正相关(均为P<0.01)。图1 Survivin在CMS组中的表达(×400)

　　3 讨论

　　低氧血症是CMS的病理生理特征之一，CMS患者处于严重的低压缺氧状态。缺氧是VEGF表达的最主要的调节因素之一。Walienbergeer等[4，5]研究证明缺氧条件下，VEGF诱导内皮细胞有丝分裂敏感性增加是由于VEGF特异性受体KDR(Kinase domaine insert containing receptor)的酪氨酸磷酸化作用加强;缺氧时KDR升高 13 倍，而 KDR与VEGF的结合力不变，说明缺氧不仅是诱导了VEGF的增加，也通过旁分泌诱导VEGFR 数量和功能的增加和增强，致使VEGF的生物效应增强。本实验显示CMS组织中VEGF的表达显著高于正常人,此结果与王洪斌等[6]及颜金花等[7]在CMS患者中观察到的血浆和血清VEGF水平变化结果相一致,提示在机体对低氧环境处于失代偿时VEGF的表达明显增高,作者认为这与VEGF的表达调节机制有关。VEGF作为缺氧反应基因(HRGs)之一，其表达受上游的HIF-1调节。HIF-1作为缺氧应答的全局性调控因子，是缺氧条件下广泛存在于哺乳动物和人体内的一种转录因子，主要受细胞内氧分压调节。当机体在高原环境下失代偿时，组织细胞内的氧分压明显降低，强烈刺激HIF-1的表达，进而上调VEGF表达，而当机体处于代偿状态时，组织细胞氧分压尚能维持在较高的水平，对HIF-1及VEGF表达的刺激弱。VEGF与其受体结合，通过信号传导，扩张血管并促进血管新生。一定程度的血管扩张和血管新生可增加局部组织的血液供应，改善局部组织的缺氧，达到代偿调节作用。但在慢性缺氧环境下，机体代偿不良时，过度表达VEGF，一方面可过度扩张组织血管，导致组织长期淤血，同时过分刺激血管新生，结果导致组织结构变化，反而影响组织的功能，导致病理状态。本研究发现CMS患者骨髓MVD增加，且VEGF与MVD成正相关，提示VEGF在CMS的发生、发展中发挥着重要作用。同时因VEGF可调节造血干细胞和巨核细胞的生存、生长和分化，可影响造血系统。而低氧可刺激造血细胞产生VEGF，能分泌到骨髓微环境中调节骨髓基质细胞的功能。VEGF的过表达在一定程度上可刺激骨髓细胞的过度增殖。缺氧状态下细胞增生,与血管新生一样,也有两方面的影响。一方面可增加组织的整体功能，红细胞增加可增强携氧能力，有利于机体发挥代偿作用，适应低氧条件;另一方面过度的细胞积累可改变组织原有的正常形态、结构，使其重构，影响其功能，甚至发生失代偿，乃至病理状态。本研究发现VEGF与Hb成正相关，说明VEGF可在CMS的造血系统病理机制中发挥重要的调节作用。

　　IAP家族是近年来发现的一类细胞内源性凋亡抑制蛋白。IAP家族成员一般包含2或3个串联的杆状病毒IAP重复序列(baculovirus IAP repeat,BIR),只有包含BIR2功能区的蛋白分子才具有结合和抑制凋亡蛋白酶的功能。Survivin是迄今为止发现的最小的IAP家族成员,结构非常独特,N端仅含有一个BIR功能区,梭基末端没有环指结构,代之以α—螺旋结构[8]。Survivin的高表达可以抑制多种因素诱导的细胞凋亡,作用于凋亡通路的下游,通过直接抑制凋亡蛋白酶caspase-3和caspase-7的活性而阻断各种刺激诱导的细胞凋亡[9，10]。Survivin的过表达导致细胞加速向S期转换,抑制G1期的静止,促进细胞增殖。同时与IAP家族其他成员不同, Survivin特异性地表达于细胞周期的G2/M期,通过螺旋结构与纺锤体微管相结合,调节细胞的有丝分裂。Survivin表达于胚胎和发育的胎儿组织,但不表达于成人的终末分化组织。本研究检测CMS 和正常人骨髓组织Survivin蛋白,发现CMS组织中的表达显著高于正常人,同时发现CMS中Survivin与Hb 成正相关，提示其可能通过抑制红细胞凋亡,破坏细胞增殖/凋亡平衡,使红细胞累积而参与CMS的发生发展。有学者研究报告[11]，Survivin 参与了血管形成过程，该研究应用VEGF和BFGF诱导静止期的内皮细胞分裂，检测 Survivin 表达水平发现血管内皮细胞内 Survivin 含量升高了16倍，且在 6～10 h达峰值,24 h开始下降，提示 Survivin可能是血管形成中生长因子诱导的保护性基因，维持血管内皮细胞的正常增殖。研究发现, Survivin是VEGF的目的基因之一,体内新生血管形成过程中Survivin显著上调与VEGF的诱导密切相关。该研究应用选择性反义靶向技术，发现VEGF的抗凋亡作用大部分是通过与VEGFR结合激活PI3K/PKB通路,诱导Survivin表达来实现的，提示VEGF可能是上调Survivin的重要因素之一。本研究发现在CMS骨髓组织中, VEGF与Survivin的阳性表达呈正相关,推测Survivin和VEGF在CMS的发生发展过程中起着重要的协同作用。综合近年文献推测，Survivin和VEGF的关联可能源于二者均为G2/M期的调控分子。一方面，Survivin过表达可使血管内皮细胞克服此期凋亡调控点而有利于完成异常的有丝分裂;另一方面，VEGF作为有丝分裂原可直接和(或)通过促进G2/M期Survivin表达，干扰内皮细胞凋亡，促进其增殖，加速血管生成。

　　综上所述, CMS骨髓组织中, Survivin及VEGF表达上调, MVD增多,这与CMS临床病理特征和生物学行为密切相关,其表达间存在正相关关系。提示三者可能在CMS的发生发展过程中发挥协同作用,抑制细胞凋亡,促进红细胞增殖和新生血管的生成。联合检测CMS中Survivin、VEGF表达和MVD,有助于深入研究CMS细胞凋亡及血管新生的分子机制,为CMS的临床干预提供新的靶点。

　　【参考文献】

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