rhGCSF对单核细胞鞘氨醇激酶活性影响的初步研究

rhGCSF对单核细胞鞘氨醇激酶活性影响的初步研究作者：黄文荣    作者单位：解放军总医院血液科，北京 100853    【摘要】  本研究旨在了解rhGCSF对单核细胞鞘氨醇激酶（SphK）活性的影响。应用黏附法分离献血员和rhGCSF动员第5天供者的外周血单核细胞并使用流式细胞术测定单核细胞富集效率，应用RTPCR检测两种来源单核细胞GCSF受体和SphK的表达情况，并应用γ32PATP掺入法测定rhGCSF处理的单核细胞胞浆SphK活性变化。研究结果表明，献血员和rhGCSF动员后供者的单核细胞均表达GCSF受体和SphK；rhGCSF处理献血员单核细胞对细胞SphK活性无明显影响；rhGCSF处理供者动员后单核细胞使SphK活性增加（39.6-87.2）%（P<0.05），且呈与剂量无明显关系的瞬时效应。结论： rhGCSF能增加rhGCSF动员后单核细胞的SphK活性。    【关键词】  重组人粒细胞集落刺激因子 单核细胞 鞘氨醇激酶    Influence of  rhGCSF  on  Activity of Sphingosine Kinase  in Monocytes  HUANG WenRong, WANG LiSheng1, DUAN HaiFeng1, GAO ChunJi, LU ZhuoZhuang1, WANG Hua1, DA WanMing    Department of Hematology , PLA General Hospital, Beijing 100853,China; Institute of Radiation  Medicine, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100850, China    Abstract    The aim of this research was to understand the influence of rhGCSF on the sphingosine kinase (SphK) activity of monocytes. The peripheral blood monocytes were collected from 6 peripheral blood progenitor cell donors on the fifth day of mobilization with rhGCSF and from 5 blood donors′  buffy coats. The   mRNA expressions of monocyte  GCSF receptor and SphK were tested with RTPCR. The changes of SphK activity of monocytes were assayed after being  treated with rhGCSF. The results showed that the  two kinds monocytes collected from both blood donors and peripheral blood progenitor cell donors mobilized with rhGCSF expressed  mRNA  of GCSF receptor and SphK. The SphK activity of monocytes collected from blood donors was not  changed significantly after being  treated with rhGCSF (P>0.05). The SphK activity of monocytes collected from peripheral blood progenitor cell donors transiently increased by  （39.6-87.2）% after  being treated by means of  rhGCSF（P<0.05） without obviously dosedependent effect. It is  concluded that  the SphK activity of monocytes collected from peripheral blood progenitor cell donors can be activated by rhGCSF.    Key words    rhGCSF;  monocyte; sphingosine kinase    J Exp Hematol 2007; 15(1):156-159    应用重组人粒细胞集落刺激因子（rhGCSF）动员外周血造血干/祖细胞会引起单核细胞数量和功能的改变［1］。鞘氨醇激酶（sphingosine kinase, SphK）是脂质代谢的一种重要激酶，是鞘磷脂的活性代谢产物1磷酸鞘氨醇（sphingosine 1phosphats, S1P）生物合成的关键限速酶，SphK通过调节S1P生成影响细胞的增殖、凋亡、迁移及黏附分子表达等多种功能［2］。本研究旨在了解rhGCSF动员外周血造血干/祖细胞是否会影响单核细胞的SphK活性。材料和方法    供者    健康造血干细胞供者6名（解放军总医院），健康献血员5名（解放军307医院）。    动员方案    造血干细胞动员方案为正常供者在全面查体完毕后给予rhGCSF（Kirin公司）10 μg/(kg·d)进行动员，连续7天。    单核细胞的黏附法分离    从血库收集健康献血员新鲜白膜层细胞10 ml和干细胞供者动员后第5天所采集的外周血干细胞悬液3 ml， 分离出单个核细胞并应用 DMEM （Gibco 公司产品）完全培养液调整细胞浓度为2×107/ml，培养2小时后弃去悬浮细胞，将贴壁细胞洗涤2次，加入3 mmol/L EDTA液消化15分钟后吹打、分离黏附细胞，重复上述黏附分离过程1次，所获取的细胞即为单核细胞，取样行流式细胞术测定细胞CD14和CD4表达情况以鉴定单核细胞分离纯度。    单核细胞rhGCSFR和SphK表达的 RTPCR检测    取5×105所分离获得的单核细胞，使用TRIzoL (Invitrogen公司产品)一步法提取细胞总RNA。取2 μg  RNA逆转录合成cDNA第一链后行PCR扩增rhGCSFR和SphK片段。rhGCSFR的上游引物5′  TCGGCTCGGAAAGGTGAA3′，下游引物5′AGCAGGTGTTTGCGTGGG3′，扩增产物645 bp；SphK的上游引物5′ATGCACGAGGTGGTGAAC G 3′ ，下游引物5′ GGAGGCAGGTGTCTTGGA AC 3′，扩增产物426 bp。PCR反应条件：96℃预变性2分钟，94℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸40秒，35个循环后72℃延伸10分钟，取产物10 μl在1.2%琼脂糖凝胶中进行电泳检测。    单核细胞的预处理    将所收集到的健康献血员单核细胞和造血干细胞供者动员后单核细胞分别取样，调整细胞浓度为1×106/ml，加入rhGCSF 100 ng/ml处理30分钟后收获细胞，并将造血干细胞供者动员后外周血单核细胞进行分组，分别加入终浓度100 ng/ml rhGCSF处理15、30、60和120分钟及终浓度分别为25、50、100和200 ng/ml的rhGCSF，处理30分钟后收获细胞。    胞浆蛋白的收集和定量    4℃离心收集处理后的单核细胞并以冰预冷PBS洗涤细胞3次，然后在冰上向细胞加入缓冲液A（20 mmol/L Tris，20%甘油，15 mmol/L NaF，1 mmol/L EDTA，40 mmol/L β甘油磷酸，1 mmol/L 原矾酸钠，1 mmol/L β巯基乙醇，1 μg/ml 亮抑酶肽（leupeptin），100 μg/ml PMSF），-70℃冻融3次；4℃、14 000×g离心30分钟，收集上清。在96孔板中加25 μl上清样品，再加BCA200蛋白检测试剂盒（Pierce公司产品）中AB混合液200  μl，以25 μl裂解液A加AB混合液200 μl作为对照，37℃孵育30分钟后测OD570值，并根据所绘制的标准曲线计算蛋白浓度。    细胞SphK1活性γ32PATP掺入法检测［3］      根据蛋白定量取各组细胞的蛋白提取上清，以使蛋白含量相同，并补加裂解液A使各组样品体积均为45 μl；加入1 mmol/L鞘氨醇（Sigma公司产品）2.5 μl混匀；加入2.5 μl  γ32PATP（10 μCi,20 mmol/L），37℃反应30分钟；加入5 μl  1 mol/L HCl和0.2 ml终止液（氯仿∶甲醇∶浓盐酸=100∶200∶1），猛烈振荡，终止反应；加入60 μl氯仿和60 μl 2 mol/L KCl萃取S1P，12 000×g离心5分钟；弃水相，取30  μl有机相点样于硅胶Gel 60层析板（Merck公司产品），在展开液（丁醇∶乙醇∶乙酸∶水=80∶20∶10∶20）中进行薄层层析45分钟；放射自显影，分析SphK1酶活性。    统计分析    应用STATA统计软件的χ2检验。结    果    单核细胞分离情况    黏附法是一种常用的粗分单核细胞的简单方法。通过流式细胞仪检测分析单核细胞CD14标记显示，本研究中单核细胞的分离富集效率为76%-88%，图1为1次单核细胞分离后流式细胞仪检测单核细胞标记CD14和CD4的表达情况。    Figure 1.  Monocyte ratio in acquired adhesion cells. Cells after twice adhesions to culture flask were collected and labeled with CD14 and CD4. A is isotype control, B shows CD14 expression ratio (85.7%).    单核细胞GCSF受体和SphK的表达    RTPCR检测所富集单核细胞的GCSFR和SphK mRNA表达，结果如图2所示，健康献血员单核细胞和造血干细胞供者动员后单核细胞均表达GCSF受体和SphK。    rhGCSF对不同来源单核细胞SphK活性的影响    100 ng/ml  rhGCSF处理献血员单核细胞和供者动员后单核细胞30分钟对细胞SphK活性的影响见表1、2。图3A和图3B分别显示rhGCSF对1名献血员单核细胞和1名供者动员后单核细胞SphK活性的影响。    rhGCSF对动员后单核细胞SphK活性影响的剂量效应    用25-200 ng/ml的rhGCSF处理供者动员后单核细胞30分钟均能使细胞SphK活性明显增加，但不同剂量间没有明显的量效差异（P>0.05）（图4）。    rhGCSF对动员后单核细胞SphK活性影响的时间效应     100 ng/ml rhGCSF处理供者动员后单核细胞不同时间对细胞SphK酶活性影响不同（P<0.05），在rhGCSF处理单核细胞15分钟后即有细胞SphK活性增加，30分钟达到高峰，2小时后基本恢复至基线水平(图5)。讨    论    本研究证实，健康献血员单核细胞和供者动员后的单核细胞均表达GCSF受体，故GCSF可以通过与其受体作用而对两种不同来源的单核细胞产生效应。已有研究报道，rhGCSF动员使供者外周血单核细胞比动员前增加5.3倍［4］，并引起单核细胞的CR1、CR3、FcRI和FcRIII表达上调［5］，CD86、HLADR表达下调［6］。rhGCSF动员后的单核细胞在受到抗原或有丝分裂原刺激时分泌的IL10和单核细胞趋化蛋白1显著增加，分泌的TNFα和IL12等致炎性细胞因子减少［7］。本研究中还发现，献血员的单核细胞和使用rhGCSF动员后的供者单核细胞均表达SphK。由于包括SphK在内的磷脂代谢物质和相关调节酶对单核细胞的免疫功能有影响［8］，本研究主要集中于观察应用rhGCSF对单核细胞SphK活性的影响。    本研究应用终浓度为100 ng/ml的rhGCSF处理献血员单核细胞30分钟对细胞SphK活性无明显影响，而处理供者动员后单核细胞却造成细胞SphK活性增加，这可能与在应用rhGCSF动员外周血造血干/祖细胞过程中rhGCSF对单核细胞的作用有关。进一步的量效和时效观察发现，25 ng/ml至200 ng/ml的不同剂量rhGCSF处理供者动员后单核细胞对细胞SphK活性增加的影响没有明显差异；rhGCSF对供者动员后单核细胞SphK酶活性影响与时间有关，rhGCSF处理单核细胞15分钟后即有细胞SphK活性增加，30分钟达到高峰，2小时后基本回落至基线水平。这一结果提示，rhGCSF对rhGCSF动员后单核细胞SphK活性的影响是与时间有关的瞬时效应。    磷脂类物质是细胞膜的主要组成成分，机体中主要含有甘油磷脂和鞘磷脂两大类脂质。参与组成细胞膜的磷脂在细胞生命活动中会产生许多的磷脂代谢产物，其中不少磷脂代谢产物是重要的信号分子，如神经酰胺、鞘氨醇、1磷酸鞘氨醇、三磷酸肌醇和二酰基甘油等。体内S1P主要来源于细胞膜鞘磷脂的分解代谢［9］，血小板和单核细胞是人血浆S1P的主要来源［10］。目前研究证实，S1P具有广泛的生物学效应，在免疫调节方面S1P能够通过T细胞表面的S1P受体调节T细胞的迁移、增殖、凋亡和细胞因子分泌，还能通过DC细胞、单核细胞等其它免疫细胞调节T细胞的免疫效应。SphK作为S1P生物合成的关键限速酶，能够通过控制S1P的生物合成而在免疫调节方面发挥重要作用。本研究发现，经rhGCSF动员后的供者单核细胞在体外受到rhGCSF的再次处理时出现SphK活性的一过性增高，而献血员的单核细胞却未观察到这种变化，这可能与动员过程中rhGCSF对供者单核细胞的信号分子影响有关，究竟哪些信号分子和信号通路的变化与SphK活性变化有关及SphK活性的变化引起了单核细胞哪些功能的改变还需要深入研究。【参考文献】1黄文荣,达万明. rhGCSF在外周血造血干细胞动员过程中对T细胞的影响及机制.中国实验血液学杂志, 2005; 13:338-3422Pyne S, Pyne NJ. Sphingosine 1phosphate signalling in mamma lian cells. Biochem J， 2000； 349（Pt 2): 385-4023Olivera A, Spiegel S. Sphingosine kinase. Assay and product analysis. Methods Mol Biol. 1998; 105: 233-2424Rutella S, Rumi C, Testa U, et al. Inhibition of lymphocyte blastogenic response in healthy donors treated with recombinant human granulocyte colonystimulating factor (rhGCSF): possible role of lactoferrin and interleukin1 receptor antagonist. Bone Marrow Transplant, 1997； 20:355-3645Ohsaka A, Saionji K, Kuwaki T, et al. Granulocyte colonystimulating factor administration modulates the surface expression of effector cell molecules on human monocytes. Br J Haematol, 1995； 89: 465-4726Mielcarek M, Graf L, Johnson G, et al. Production of interleukin10 by granulocyte colonystimulating factormobilized blood products: a mechanism for monocytemediated suppression of Tcell proliferation. Blood, 1998； 92:215-2227Saito M, Kiyokawa N, Taguchi T, et al. 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