吸收放散法在ABO疑难血型鉴定中的应用

作者:彭进,张建耕,邢荷香,王宝

    【摘要】  目的 通过采用吸收放散法解决ABO疑难血型鉴定的问题，提出吸收放散法是免疫血清学实验中非常重要的技术手段。方法 4例ABO血型初筛结果为正反定型不符的样本，筛查ABO以外抗体和直接抗人球蛋白试验，经吸收放散后，观察样本的放散液与A或B标准细胞的凝集情况，并采用流式细胞术对比检测同等体积的待测血清和放散液中抗体的含量。结果 ABO以外抗体和抗人球蛋白试验为阴性，4例样本的放散液与A或B标准细胞发生凝集，正反定型相符。流式细胞术检测显示放散液中抗体的含量高于待测血清。结论 吸收放散法能够起到浓缩抗体的作用，既可以用于检测抗原，也可以用于检测抗体。灵活运用吸收放散法，能够准确鉴定ABO血型。

【关键词】  ABO疑难血型 正反定型不符 吸收放散法

    临床输血工作中的一项主要工作任务就是鉴定ABO血型，其样本一般来源于无偿献血人群和临床需要输血的患者。因此，准确鉴定血型尤其是ABO疑难血型是保障输血安全的最重要的环节。目前，绝大多数实验室并没有开展基因鉴定ABO血型的技术工作，对于ABO疑难血型的鉴定仍然依赖于血清学的方法，而吸收放散法是免疫血清学实验中非常重要的技术手段。

　　1  材料和方法

　　1．1  血液样本

　　来源于无偿献血人群和临床需要输血的患者，共4例，均为ABO正反定型不符者。血样提供者基本资料及血型初步鉴定结果如下：样本1（王某），男，21岁，学生，无偿献血后，血样经血液中心血检科检验为正定型为A型，反定型为AB型；样本2（唐某），女，20岁，学生，无偿献血后，血样经血液中心血检科检验为正定型为O型，反定型为B型；样本3（种某），男，18岁，临床诊断为AML-M2a，输血前经输血科检验正定型为O型，反定型为A型；样本4（宋某），女，59岁，临床诊断为CML，输血前经输血科检验正定型为O型，反定型为B型。

　　1.2  试剂和仪器

　　ABO单克隆抗体购自长春博德生物制品公司，FITC标记的羊抗人IgM购自北京博奥森生物公司，标准红细胞(A/B型RBC)为自制，人源抗-AB抗体为自制，水浴箱购自德国GFL，流式细胞仪为美国MD Facscalibur。

　　1.3  吸收放散试验方法

　　对于ABO正反定型不符样本，进行吸收放散试验，以分别检测红细胞表面的ABO抗原和样本血清中的抗-A/B抗体［1］。将待测血清中加入标准细胞(A/B型RBC)，待测红细胞悬液中加入人源抗-AB抗体，4℃孵育1hr，每隔15min振摇一次；生理盐水洗涤至少4遍，按1∶1的比例加入生理盐水，56℃放散10min，离心后吸取上清液，加入标准红细胞，混合均匀，RCF177g离心1分钟，轻轻摇动试管，使沉于底层的红细胞浮起，肉眼和显微镜下观察凝集反应结果。

　　1.4  流式细胞术检测抗体方法

　　吸取样本1、2的血清和该样本放散液各50μl，分别加入标准红细胞50μl，4℃孵育1hr，每隔15min振摇一次；生理盐水洗涤3次，PBS(pH 7.3)洗涤1次，用PBS(pH 7.3)调整压积为5％；加入等量的FITC标记的羊抗人IgM，25℃避光孵育30min，PBS(pH 7.3)洗涤3次，加PBS至总量为300μl，以标准红细胞加入FITC标记的羊抗人IgM为阴性对照，用流式细胞仪检测。

　　2  结果

　　2.1  吸收放散试验检测ABO血型的结果

　　4例样本ABO血型初筛结果为正反定型不符，ABO以外抗体筛查阴性，直接抗人球蛋白试验阴性，表明ABO正反定型不符不是由于ABO以外抗体引起的；试验结果见表1，经吸收放散试验后，样本红细胞和血清的放散液与A或B标准细胞发生凝集反应，鉴定结果为正反定型相符，能够准确鉴定出ABO血型。由吸收放散试验结果可推知，导致正反定型不符是由于1、2样本血清中抗体量下降和3、4样本红细胞A、B抗原性下降造成的。图1为样本1血清与B型RBC反应结果，从图中可以看出，显微镜下，初筛实验样本血清与B型标准细胞有很弱的凝集，肉眼无法观察到；样本血清与B标准细胞吸收放散后，放散液与B型标准细胞有明显凝集出现，提示样本1血清中有较弱的抗-B抗体，反定型为A型；其他凝集反应结果类似。表1  4例ABO正、反定型不符样本的初筛试验和吸收放散试验的鉴定结果（略）

　2.2  流式细胞术检测的结果

　　样本1、2的检测结果显示，与样本放散液反应的细胞的阳性率和平均荧光强度均高于与样本血清反应的细胞的结果，说明等体积的放散液中抗体含量明显高于样本血清，吸收放散法实际起到了浓缩抗体和抗体粗纯化的作用，使反应的灵敏度大为提高，结果见表2。表2  流式细胞术检测抗体含量结果（略）

　　3  讨论

　　ABO抗原受控于A、B、H基因，不同个体红细胞膜上表达不同的抗原，形成了A、B、O、AB四种型别。ABO血型系统的共同特点是红细胞上含有某种抗原，血清中就不存在对应抗体。ABO血型系统正常型别和绝大多数亚型个体均符合这种规律，故可根据此规律用血型单克隆抗体检测红细胞上的抗原(正定型)，或用标准红细胞检测检者血清中的抗体(反定型)来判断被检者血型［1-2］。引起ABO正反定型不一致的原因除技术操作失误外主要有以下原因：1）血液中存在IgM性质的自身冷抗体：由于自身冷抗体(冷凝集病，CHD)而导致自身溶血的病人，在低于37℃时血细胞自发凝集，影响正反定型；2）红细胞抗原表达弱或缺失：A、B抗原的表达可在白血病和H基因变异情况下被抑制导致A、B抗原表达太弱；3）血液中含高水平可溶性血型物质：极少数有卵巢囊肿的妇女，由于含高浓度的可溶性血型物质，使抗原减弱或消失，此血型物质分泌进入血液可以中和抗-A或抗-B。当使用未洗涤的红细胞用于ABO 定型时，血型物质就会中和抗-A或抗-B，引起假阴性反应；4）新生儿、免疫缺陷或紊乱病人及老年人出现抗-A、抗-B抗体缺失或下降；5）红细胞的多凝集现象：红细胞具有不正常的膜结构，可被正常成人血清凝集。起因是微生物酶引起膜的改变，以及膜上糖基合成不完善；6）血液中不正常血清蛋白：白蛋白/球蛋白比例失调的血清引起红细胞产生缗钱状假凝集［3-5］。在本实验所遇到的样本有来自健康的无偿献血者，也有来自血液病患者，对于这些特殊的正反定型不符的样本，首先通过ABO以外抗体筛查和直接抗人球蛋白试验排除由于不规则抗体引起的正反定型不符的可能后，就需要采用更敏感的方法来重新鉴定血型。吸收放散法是一种重要而且实用敏感的血清学方法，吸收即为用红细胞（抗原）在最适条件下充分吸收抗体，而放散则是将吸附于红细胞上的抗体用物理或化学的方法使其脱离下来，再采用指示应重视红细胞反映试验结果。吸收和放散的过程实际起到了浓缩抗体和抗体的粗纯化的作用，而这些抗体可以来自于血清中的弱抗体，也可以是红细胞上弱抗原吸附的试剂抗体，因此，吸收放散法可以用于检测抗原，也可以用于检测抗体。在条件有限的情况下，灵活运用吸收放散法，也能够准确鉴定ABO血型［6-7］。

【参考文献】  　　［1］安万新.输血检验学［M］.大连:大连出版社,2002:90-91

　　［2］王培华.输血技术学［M］.北京:人民卫生出版社,2002:133-155

　　［3］Issitt PD,Combs MR,Bumgarner DJ,et al.Studies of antibodies in the sera of patients who have made red cell autoantibodies［J］.Transfusion,1996,36(6):481-486

　　［4］毛菊珍，张莉尼，陈忠.红细胞ABO血型抗原和血清抗体定型不合［J］.临床检验杂志，2001，19（3）：189-190

　　［5］马曙轩，刘景汉，王全立，等.24例ABO血型正反定型不一致受血者的血型血清学分析［J］.临床输血与检验，2005，7（4）：280-282

　　［6］吴敏慧，刘毅.ABO血型正反定型不符确认试验结果分析［J］.临床输血与检验，2005，7（3）：198-199

　　［7］Engelfriet CP.What is the best technique for the detection of red cell alloantibodies［J］.Vox Sang,1995,69(3):292-300