GCSF的免疫调节作用及其在异基因造血干细胞移植中的应用

作者：常英军，赵翔宇，黄晓军    作者单位：北京大学人民医院，北京大学血液病研究所，北京 100044

【摘要】  粒细胞集落刺激因子（granuloctye colonystimulating factor，GCSF）在动员造血干细胞的过程中对体内多种免疫细胞的功能具有重要的调节作用，深入认识GCSF的免疫调节作用对于减轻急性移植物抗宿主病（Graftversushost diseases, GVHD）的发生、维持和增强移植物抗白血病（Graftversusleukemia, GVL）效应以及降低造血干细胞移植患者的复发率等具有重要意义。本文就GCSF对外周血及骨髓移植物的免疫调节作用、GCSF的免疫调节作用与AlloHSCT和细胞因子免疫调节作用的研究进行了综述。

【关键词】  粒细胞集落刺激因子

     Effect of Granulocyte ColonyStimulating Factor on Immunological Regulation and Its Application in Allogeniec Hematopoietic Stem Cell Transplantation——Review

    CHANG YingJun, ZHAO XiangYu, HUANG XiaoJun

    Institute of Hematology  and People Hospital, Peking University , Beijing 100044, China

    Abstract     The granulocyte colonystimulating factor (GCSF) plays an   important role in regulating fumction of immunocytes in process of mobilizating hematopoietic stem cells.  The deep  understanding of the immunoregulatory effects of GCSF has important significance to improve  the outcomes of patients with hematological malignancies after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation, included alleviating acute graftversushost disease, maintaining or enhancing graftversusleukmia effects and decreasing the relapse rates. In this article, the immunoregulatory effect of  GCSF on graft of peripheral blood and bone marrow, the immunoregulation of GCSF and allohematopoietic stem cell transplantation, as well as the prospective trend  of research on immunoregulatory effets of GCSF were reviewed.

    Key words    granulocyte colonystimulating factor; allogeneic hematopoietc stem cell transplantation; immunological regulation

    J Exp Hematol 2007; 15(5):1121-1125

    移植免疫问题是异基因造血干细胞移植（allogeneic hematopoietic stem cell transplantation, alloHSCT）的核心内容之一，而GVHD和GVL效应又是移植免疫的关键环节［1-4］。众所周知T细胞活化、增殖、分化在GVHD和GVL效应方面起着重要作用，T细胞功能的发挥又需要抗原递呈细胞（antigenpresenting cells, APC）、黏附分子、共刺激分子以及调节性T细胞（regulatory T cells, Treg）等多种免疫辅助细胞和辅助分子的参与。近年来的研究表明，GCSF可以从T细胞、APC以及调节性T细胞等角度对干细胞移植物的免疫功能进行调节，诱导移植物中的T细胞产生免疫耐受［3-8］。GCSF在alloHSCT中的应用，不仅扩展了可供选择的干细胞移植物来源、减轻了急性GVHD的发生，而且使GVHD和GVL的分离成为可能，因此对改善alloHSCT患者的预后具有重要意义。

    GCSF对外周血移植物的免疫调节

    作用GCSF对T细胞的调节作用

    健康供者体内应用GCSF可抑制T细胞的异种反应性，使T细胞处于免疫低反应状态，同时通过增加T细胞分泌白细胞介素4（IL4），并降低干扰素γ（IFNγ）的分泌水平，促进CD4+ T细胞向Th2极化［5,7］。体内外实验证实，GCSF直接诱导CD4+和CD8+ T细胞表达GCSF受体，这种表达呈时间依赖性；GCSF重复刺激能维持GCSF受体在CD4+ T细胞上的表达，这可能是GCSF对T细胞免疫调节的重要机制之一［3］。GCSF可使CD4+ T细胞的GATA3基因表达水平增加7倍以上，GATA3是T细胞特异的转录因子，选择性地表达于Th2细胞，控制Th0细胞向Th2细胞的定向分化。GATA3可与STAT5共同稳定Th2表型。GCSF还可抑制CD4+ T细胞中转录调节复合体ISGF3γ亚单位/P48的基因表达，P48可与STAT3、STAT2形成转录复合体，后者是IFNγ信号的重要调节分子。GCSF促使ISGF3γ亚单位表达下调，抑制IFNγ的分泌［3］。GCSF还可直接或间接通过辅助细胞下调CD4+ T细胞上CD5、CD44H以及LFA1等黏附分子和共刺激分子的表达，从而降低T细胞的同种异体反应性。可见，黏附分子不仅在干细胞动员中起作用，而且还参与GCSF的免疫调节过程［3,9］。

    GCSF对APC的调节作用

    APC除了递呈抗原在GVHD发生过程中发挥重要作用外，还参与免疫耐受的诱导和维持，其中未成熟的树突状细胞（DC）和浆细胞样DC（DC2）与免疫耐受的关系尤为密切。体内应用GCSF可使外周血移植物中DC2增加5倍左右，DC2可促使Th0细胞向Th2极化，并增强调节性T细胞的调节功能［10］。业已证实，GCSF通过下调DC上的CD62L和上调CCR7的表达来增加外周血移植物中DC2的数量［11］。

    GCSF的免疫调节作用及其在异基因造血干细胞移植中的应用GCSF动员扩增的粒单核系前体细胞与GVHD的调节有关，这些粒单核系前体细胞在alloHSCT后可分化为MHCⅡ+、CD80/CD86+、CD40的APC，过继输注这些未成熟的髓系APC后，该类APC能够以MHC限制方式诱导受者产生抗原特异的、分泌IL10的调节性T细胞，尤其是CD4+CD25+调节性T细胞，进而促进免疫耐受的产生。有趣的是上述粒单核系前体细胞在防止GVHD的同时并不降低GVL效应［12］。

    另外，GCSF动员可显著升高供者血清中IL10和IFNγ的水平［13］，并使外周血移植物中的CD14+ 单核细胞的数量增加50倍以上，后者可抑制同种异体抗原诱导的T细胞增殖、干扰或下调CD4+T细胞的CD28信号传导［5］；GCSF动员的单核细胞分泌高水平的具有免疫调节作用的IL10，并能通过FasFasL途径诱导CD4+ T细胞凋亡进而抑制T细胞的功能；单核细胞来源的巨噬细胞还能干扰T细胞CD3ζ链的表达进一步调节T细胞的功能［14］。GCSF动员的单核细胞还诱导T细胞表达NKRs，这些NKR+ T细胞对白血病细胞系、实体瘤细胞系以及病人来源的白血病细胞具有潜在的细胞毒活性，提示GCSF动员供者扩增的NKR+ T细胞可作为异基因T细胞用于诱导GVL效应［15］。将富含IL10和IFNγ的供者血清与单核细胞共同培养可使后者分化成熟为DC样细胞群，这些DC样细胞低分泌IL12，异体刺激能力弱；将上述细胞群与初始CD4+ T细胞共同培养后，可以产生分泌IL10和（转化生长因子β）TGFβ的、抗原特异的调节性T细胞［13］。

    GCSF对调节性T细胞的作用

    在GCSF动员的供者血清存在的条件下，体外用同种异体抗原刺激供者来源的CD4+ T细胞，后者可产生免疫低反应性，并表现为Tr1样功能表型，此类细胞分泌IL10、TGFβ，并以抗原非依赖的方式抑制自身T细胞的异体增殖反应。GCSF可动员CD4+CD25+FoxP3+ 调节性T细胞和CD4-CD8-TCRα+β+的抑制性T细胞进入外周血。Zou等［16］发现，CXCR4配基—CXCL12/SD1表达的下调可能是CD4+CD25+ 调节性T细胞动员至外周血的重要机制。CD8+CD28- T细胞在供者外周血采集物中的数量也显著增加，CD8+CD28- T细胞表达TCRνβ受体，与Th细胞共同识别表达MHCⅠ和MHCⅡ类分子的APC，并通过诱导单核细胞和DC的抑制性受体——免疫球蛋白样转录子3（ILT3）、ILT4高表达，下调APC上B7、CD40等共刺激分子的表达，导致APC出现免疫耐受，进而抑制Th细胞的活化和增殖［2,5］。

    GCSF对黏附分子和共刺激分子的调节

    黏附分子和共刺激分子在T细胞迁移、归巢、黏附、活化、增殖和分化过程中发挥重要作用。Arpinati等［10］发现，动员的DC2在体外经粒巨噬细胞集落刺激因子、IL3和肿瘤坏死因子α（TNFα）活化48小时后，共刺激分子CD40、CD80、CD86的表达上调，这些活化的DC2可诱导初始CD4+CD45RA+ T细胞向Th2极化，分泌IL10、IL4等细胞因子。我们发现，GCSF体内应用虽然对外周血采集物T细胞上CD28的表达无影响，却能够下调单核细胞和B细胞上CD80、CD86的表达［2］；在骨髓则不然，GCSF可同时下调骨髓T细胞上的CD28以及单核细胞、B细胞上的CD80、CD86表达［6］；可见，共刺激分子信号的减弱是T细胞免疫低反应性的重要机制之一。

    值得注意的是白细胞功能相关抗原1（leucocytefunctionassociated antigen1, LFA1)，它不仅作为共刺激分子增强T细胞受体依赖的细胞增殖，而且LFA1还是初始T细胞向外周淋巴组织归巢有关的归巢受体。GCSF体内应用可使外周血采集物中T细胞上的LFA1α基因表达下降3倍，由于淋巴细胞归巢的周淋巴器官是其对新抗原致敏的主要场所，并由归巢受体与对应的配基相互作用而启动［3］。因此，供者T细胞上LFA1α的下调剥夺了供者T细胞对宿主抗原的反应能力，减轻了其同种异体反应性。

    GCSF对细胞因子的调节

    GCSF可下调IL1β、IL12、IFNγ、IL18、TNFα以及巨噬细胞趋化蛋白1α（MIP1α）等的分泌，促进IL4、IL10、TGFβ以及血清肝细胞生长因子（HGF）的产生，其中IL4和IL10是Th2型细胞因子可防止GVHD的发生，而HGF则是一种血管生成因子，可促进微血管形成，在体内HGF可诱生耐受性DC样细胞［17］。TGFβ是重要的免疫负调控因子，它可抑制IL2依赖的T淋巴细胞增殖和成熟，阻止初始T细胞获得效应功能；TGFβ还可通过CD4+CD25+ 调节性T细胞介导对T细胞的免疫抑制效应，其中CD4+CD25+ 调节性T细胞分泌游离和膜结合型的TGFβ1是TGFβ免疫调控机制不可缺少的环节［18］。

    综上所述，GCSF通过直接或间接途径，从基因、mRNA、蛋白质、分子以及细胞等不同水平多层次调节T细胞、APC和调节性T细胞等的功能，由此构成复杂的网络调控并诱导T细胞产生免疫耐受［2-8,10-18］。最近Vasconcelos等［19］发现，体内外应用GCSF可诱导产生低密度粒细胞（lowdensity granuloctye，LDG），LDG能显著抑制T细胞分泌IFNγ，从而阻止急性GVHD的发生；此外，LDG也可作用于肠道微生物群阻止大量肠道细菌的移位，从而抑制GVHD第一阶段的炎症反应。

    GCSF对骨髓移植物的免疫调节作用

    GCSF体内应用在诱导外周血T细胞产生免疫耐受的同时，也诱导骨髓中的T细胞产生了免疫低反应性，同样可促使骨髓移植物中的Th0细胞向Th2细胞极化，但骨髓采集物中T细胞的免疫反应性更低于外周血采集物中的T细胞，而且骨髓中的Th0细胞更易向Th2方向极化［6,8］。研究表明，GCSF选择性增加骨髓移植物中的单核细胞、DC2的数量，并下调骨髓中T细胞上CD28和B细胞、单核细胞上的CD80/CD86共刺激分子的表达可能参与骨髓移植物中T细胞免疫低反应性和Th2极化的形成。临床和实验资料表明，GCSF动员的外周血采集物和骨髓采集物在免疫学上的差异是异基因外周血造血干细胞移植（allogeneic peripheral blood stem cell transplantation，alloPBSCT）和GCSF动员的异基因骨髓移植在移植后GVHD发生率和程度的不同的免疫学基础［8,20］。

    GCSF的免疫调节作用与alloHSCT

    GCSF优化干细胞移植物来源

    目前GCSF动员的外周血移植物已广泛用于AlloHSCT，尤其是高危白血病患者的治疗，并在GVL方面显示了优越性，但慢性GVHD仍是影响alloPBSCT患者预后和生存质量的重要问题。临床随机对照研究表明，GCSF动员的骨髓移植除了具有与alloPBSCT相同的植入速度外，其GVHD的发生率也显著低于alloPBSCT，这表明GCSF预激的骨髓有可能成为一种新的移植物来源［20］；GCSF预激的骨髓和动员的外周血在单倍体混合移植方面的成功则预示着移植供者来源的多元化，有可能结束alloHSCT供者来源缺乏的时代［21］。

    GCSF动员的移植物减轻aGVHD的机制

    AlloHSCT预处理后所致的组织损伤和局部炎症导致IL6、IL1以及TNFα等因子释放和宿主APC活化，活化的宿主APC与供者初始CD4+和CD8+ T细胞相互作用，驱使T细胞向Ⅰ型细胞极化，并产生大量IFNγ，后者预激供者和宿主来源的单核巨噬细胞，同时细菌脂多糖和肠道来源的免疫刺激因子也促使单核细胞活化，结果后者分泌大量前炎症因子IL1、TNFα，并介导组织损伤和GVHD的炎症效应途径。同时，供者的CD8+ T扩增，获得细胞溶解功能，通过穿孔蛋白、颗粒酶以及肿瘤坏死因子相关促凋亡配体（TRAIL）等细胞溶解机制产生细胞溶解效应；最终形成aGVHD特征性的“细胞因子风暴”，以MHC依赖或非依赖方式损伤靶组织［1,2］。GCSF动员的移植物通过3种主要的免疫调节效应减轻GVHD［3-8,10-18］：① 供者T细胞上的GATA3表达促使初始T细胞向Th2方向极化，限制Th1依赖的单核细胞活化；② GCSF通过IL10诱导Tr1调节性细胞；③ GCSF扩增供者体内的未成熟髓系祖细胞和浆细胞样DC等调节性APC，并在移植后促使分泌IL10的调节性T细胞产生，GCSF诱生的调节性T细胞通过分泌IL10和TGFβ进一步抑制aGVHD的炎症效应阶段，减轻靶组织的损伤。

    GCSF动员的移植物增强GVL效应

    GCSF动员及其类似物可扩增供者iNKT细胞，移植物回输后宿主残存的APC能够直接通过CD1d呈递糖脂类抗原或间接通过1L12、IL18等细胞因子活化iNKT细胞，活化的iNKT细胞分泌大量的IFNγ等细胞因子，进一步活化宿主APC，活化的宿主APC则激活NK细胞、CD4+、CD8+T细胞等效应细胞［22,23］。另外，NK细胞也可通过下列途径活化：① NK细胞的活化受体NKG2D、CD70等与宿主APC上的NKQ2D2和CD27相互作用；② 包括IFNα/β、IL12、IL15、IL18等在内的因子也参与NK活化。活化的NK细胞、CD4+、CD8+T细胞介导GVL效应的机制如下：①在杀伤细胞免疫球蛋白样受体（KIR）不合的情况下，NK细胞通过与活化受体相互作用发挥GVL效应；或通过识别无MHC1类抗原表达的白血病细胞发挥杀伤作用；②活化的供者CD4+T和CD8+T细胞分别以MHCⅡ和MHCⅠ限制方式作用于表达相关抗原的白血病靶细胞介导GVL效应［7,23,24］。

    GCSF动员的外周血移植物用于恶性血液病复发的防治

    供者淋巴细胞输注（DLI）是恶性血液病复发后的有效治疗手段，然而DLI后的全血细胞减少和GVHD的高发生率是限制了其临床应用［24］。近年来，GCSF动员的外周血采集物（GPBSC）输注在复发恶性血液病患者中的应用显示了独特的优势，具有GVHD发生率低以及少或无全血细胞减少发生等优点。国内刘代红等［25］应用GPBSC预防性输注防止高危白血病患者复发取得很好疗效，接受治疗的12例患者共进行GPBSC输注16次，输注后4例患者发生了Ⅰ-Ⅱ度急性GVHD，1例Ⅲ度GVHD，7例发生慢性GVHD；无1例患者出现全血细胞减少，中位时间为443天（295-608天）后，10例患者处于无复发活存状态，未出现GVHD相关的死亡。

    细胞因子免疫调节作用的研究前景

    GCSF作为一种新的T细胞免疫耐受调节剂已得到国内外许多学者的认可，目前包括GCSF类似物、ProGP1（GCSF和Flt3L的嵌合蛋白）、IL11以及AMD3100（CXCR4拮抗剂）等在内的多种干细胞动员因子对供者的免疫调节作用也开始受到关注，GCSF联合SCF增强GVL效应以及GCSF联合IL11显著降低GVHD等假设也在动物实验中得以证实，大量临床和实验结果为细胞因子的免疫调节作用研究展示了诱人的前景 ［4,12,26,27］。然而，许多问题尚待今后的研究去解决：①在既能用于干细胞动员，又有免疫调节作用的细胞因子中，那种因子的免疫调节作用最优？②GCSF诱导T细胞免疫耐受的确切机制目前还不清楚？③GCSF等细胞因子能达到最佳免疫调节作用的最适剂量是多少？最佳应用时间是多久？④那些细胞因子组合对供者移植物的免疫调节作用优于GCSF？⑤如何使这些细胞因子在尽量降低GVHD的同时最大限度的发挥GVL效应？等等。总之，随着细胞因子免疫调节作用研究的深入和上述问题的逐步解决，我们必将进一步提高干细胞移植的水平，从而造福更多的移植患者。

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