大黄素抑制HL60/ADR耐药细胞增殖和诱导凋亡的作用

作者：陈英玉， 郑合勇， 胡建达， 郑志宏， 郑静， 连晓岚， 吕联煌    作者单位：福建医科大学附属协和医院 福建省血液病研究所,福州 350001

【摘要】  本研究探讨中药大黄素（emodin）对人白血病耐药细胞株HL60/ADR的增殖、凋亡影响及其相应的可能作用机制。采用MTT法绘制细胞生长曲线；集落培养法观察大黄素对HL60/ADR克隆形成的影响；细胞周期分析、线粒体跨膜电位检测、Caspase3酶活性检测、Annexin V FITC/PI法、TdT酶介导的原位缺口末端标记法(TUNEL)分析凋亡细胞；RTPCR及Western blot法检测大黄素作用后不同时间段bcl2、cmyc mRNA及Bcl2、cMyc、Caspase3前体蛋白表达水平的变化。结果表明， 大黄素对HL60/ADR细胞增殖具有明显的抑制作用，呈时间和浓度依赖性。较低浓度大黄素即可抑制HL60/ADR细胞集落形成，IC50值为5.79 μmol/L。细胞周期分析显示，与对照组比较，40、80 μmol/L浓度组细胞被阻滞于G0/G1期比率明显增高（p< 0.01），G2/M期细胞比率降低（p<0.01），而20 μmol/L浓度组细胞周期改变差异不具有显著性（p > 0.05），各浓度组均检测到典型的亚二倍体峰（凋亡峰）。大黄素作用12小时HL60/ADR细胞线粒体跨膜电位降低，Annexin V FITC/PI法检测到早期凋亡细胞，作用24小时caspase3酶活性显著升高，作用48小时TUNEL法检测到晚期凋亡细胞，细胞凋亡率呈药物浓度依赖性。大黄素作用HL60/ADR细胞不同时间段，bcl2、 cmyc mRNA 和Bcl2、cMyc、Caspase3前体蛋白表达水平均有不同程度下调，并呈时间依赖性。结论 ：大黄素能够有效抑制HL60/ADR细胞增殖，并诱导其凋亡， bcl2、cmyc表达水平下调，线粒体跨膜电位水平降低和caspase3激活可能参与了该过程。

【关键词】  细胞增殖

    Inhibitory Effects of Emodin on Drugresistant HL60/ADR Cell Proliferation and Its Induction of Apoptosis

    CHEN YingYu, ZHENG HeYong, HU JianDa, ZHENG ZhiHong, ZHENG Jing, LIAN XiaoLan, L LianHuang

    Fujian Institute of Hematology, Union Hospital, Fujian Medical University,Fuzhou 350001,China

    Abstract    The study was aimed to investigate the effects of emodin on the proliferation and apoptosis  of adriamycinresistant HL60/ADR cells, and to explore the underlying mechanism. The cell viability and colony formation were detected  by MTT assay and colony formation assay respectively. Apoptotic cells were tested by means of cell cycle analysis,    mitochondrial transmembrane potential levels, caspase3 activity detection, Annexin V FITC/PI staining and TUNEL labeling. RTPCR was used to analyze the bcl2 and cmyc mRNA expressions. The protein expressions of Bcl2，cMyc and caspase3 precursor were determined by Western blot. The results showed that HL60/ADR cell growth was significantly inhibited by emodin in dose and time dependent manners. Cell colony formation obviously decreased with IC50 5.79 μmol/L. G0/G1 phase cell population increased while G2/M phase cells decreased in 40 and 80  μmol/L groups compared with control group （p<0.01）, and no significant difference of cell cycle was observed in 20 μmol/L group（p> 0.05）. The typical hypodiploid peak  (apoptotic peak) appeared in each dose group. The levels of mitochondrial transmembrane potential of HL60/ADR cells decreased and caspase3 activity  increased when incubated with emodin for 12 and 24 hours respectively. Apoptosis occured in a dosedependent manner,and its earlier and later stages were identified by AnnexinV FITC/PI staining and TUNEL labeling methods respectively. The expressions of bcl2,cmyc mRNA and Bcl2,cMyc,caspase3 precursor protein were all downregulated in a timedependent manner after treatment with emodin at different times. It is concluded that emodin  efficiently inhibits growth and induces apoptosis on HL60/ADR cells, which may be related with the downregulation of mitochondrial transmembrane potential and  expressions of bcl2 and cmyc,  as well as  upregulation of caspase3 activity.

    Key words    emodin; HL60/ADR cell; proliferation; apoptosis

    J Exp Hematol 2007; 15(5):955-960

    大黄素（emodin），化学名称为6－甲基－1,3,8－三羟基蒽醌，是从大黄属、鼠李属、蓼属和番泻叶等中药中提取的一种蒽醌类单体化合物。研究表明，大黄素能够抑制包括神经外胚层肿瘤、肺癌、肝癌、髓系白血病等多种肿瘤细胞增殖并诱导其凋亡［1-5］，具有明显的抗肿瘤活性，但对人白血病耐药细胞株HL60/ADR作用的研究未见国内外文献报道。本研究通过多种检测方法观察大黄素在不同作用浓度和不同作用时间下对HL60/ADR细胞增殖、凋亡的影响，并对其中可能涉及的机制进行了初步探讨。

     细胞株及试剂

    HL60/ADR是由阿霉素诱导的人白血病耐药细胞株，引自中国医学科学院血液学研究所。大黄素为南京青泽医药科技开发有限公司产品，溶解于二甲亚砜(DMSO)中，配制成50 000 μmol/L的母液浓度，-20℃保存。

    细胞生长的MTT法测定

    HL60/ADR细胞的初浓度为2.0×105/ml，接种于96孔培养板（Costar）。实验组分别含10、20、40 μmol/L大黄素，对照组含与最高浓度组等量的DMSO。每组重复3个平行孔，每孔100 μl。用药24、48、72、96和120小时后，每孔加入5 mg/ml MTT(Sigma公司产品)10  μl，继续培养4小时后，小心地吸去上清，每孔加入100 μl DMSO，在酶标仪（STAT FAX2100型）上充分震荡混匀，进行双波长492 nm和630 nm比色，测定吸光度值（A值），绘制HL60/ADR细胞增殖曲线。

    集落形成试验

    收集细胞接种于24孔培养板（Costar），分为对照组和1.25、2.5、5、10和20 μmol/L 5种浓度大黄素加药组。每组重复3个平行孔，每孔接种200个细胞，总体积1 ml，并含0.7%的甲基纤维素，常规培养10天后倒置显微镜下计算细胞数。大于40个的细胞团为1个集落，对照组集落形成率大于40%者实验有效。集落形成率=（各组集落数/200）×100%；集落形成抑制率=（1加药组集落数/对照组集落数）×100%。以药物浓度对抑制率做线性回归计算IC50值［6］（IC50值为集落形成抑制率达到50%时的药物浓度）。

    线粒体跨膜电位改变检测

    收集对照组和20、40、80 μmol/L大黄素加药组作用12小时的细胞，按照MitoCaptureTM线粒体凋亡检测试剂盒（Biovision）说明书进行操作，其具体步骤为：加1 μl  MitoCapture Reagent到1 ml  37℃预热的孵育缓冲液中充分混匀后，13 000×g离心1分钟取上清，将约1.0×106细胞沉淀团重悬于该上清液中，于37℃、5% CO2温箱孵育1520分钟，离心弃上清，细胞沉淀团重悬于1 ml  37℃预热的孵育缓冲液中，立即在流式细胞仪（BD FACScan）上检测结果。

    早期凋亡细胞的Annexin V FITC/PI检测

    收集对照组和20、40、80 μmol/L大黄素加药组作用12小时的细胞，按照Annexin V FITC/PI凋亡检测试剂盒（Beckton Dickinson）说明书操作。用1×binding buffer调整细胞浓度为1.0×106/ml，吸取100 μl到另一EP管，加入5 μl FITC和5 μl PI试剂，轻轻混匀，室温放置暗处15分钟，再加入400 μl 1×binding buffer，在1小时内进行流式细胞仪分析。

    Caspase3酶活性检测

    20、40、80 μmol/L大黄素作用24小时后收集对照组和各药物组细胞，按照CaspGLOWTM Fluorescein Active Caspase3 Staining Kit(Biovision)说明书进行操作。从1.0×106/ml浓度的细胞悬液中吸取300 μl，加1 μl FITCDEVDFMK, 于37℃、5% CO2温箱孵育0.5-1小时，离心弃上清，将细胞重悬于500 μl工业 Wash Buffer,离心，再重复后者1次，最后将细胞重悬于300 μl  Wash Buffer，置于冰上，进行流式细胞仪分析。

    细胞凋亡的TdT酶介导的原位缺口末端标记法(TUNEL)检测

    采用DeadEndTMColorimetric TUNEL System 试剂盒（Promega），其步骤如下：收集对照组和20、40、80 μmol/L大黄素加药组作用48小时后的细胞，涂片，干燥后用4%低聚甲醛固定，0.2% TritonX100渗透细胞，缓冲液平衡后，滴加TUNEL反应液，置于湿盒内，37℃孵育60分钟，2×SSC终止反应，0.3% H2O2去除内源性过氧化物酶，再与辣根过氧化物酶连接的抗体反应，加DAB底物，显色。镜下观察细胞核染成棕褐色者为凋亡细胞，计数1 000个细胞，计算阳性率。

    细胞周期分析

    收集20、40、80 μmol/L各组药物作用48小时后的细胞及对照组细胞，按Cell Cycle Test Plus DNA Reagent Kit（Beckton Dickinson）说明书操作。先用1 ml Buffer Solution 重悬细胞，重复3次，调整细胞浓度为1.0×106/ml，加250 μl Solution A 混匀后室温孵育10分钟，再加入Solution B 200  μl，室温孵育10分钟，最后加200 μl Solution C，混匀，冰上孵育10min，进行流式细胞仪分析。

    bcl2、cmyc mRNA表达变化的RTPCR检测

    收集对照组和40 μmol/L大黄素作用12、24、48、72小时后的细胞，用TRIZOL试剂（Life Technology）提取总RNA，取2 μg反转录成cDNA，以βactin为内参照进行PCR扩增。βactin上游引物：5'GGCATGGGTCAGAAGGATTCC3',下游引物：5'ATGTCACGCACGATTTCCCGC3'，扩增产物为500 bp。bcl2上游引物：5'CGACGACTTCTCCCGCCGCTACCGC3',下游引物：5'CCGCATGCTGGGGCCGTACAGTTCC3'， 扩增产物为318 bp。反应条件：94℃预变性5分钟，94℃变性1分钟，62℃退火30秒，72℃延伸30秒，共35个循环，最后延伸7分钟。cmyc上游引物：5'TCCTGGCAAAAGGTCAGAGT3'，下游引物：5'GTTGTGTGTTCGCCTCTTGA3'，扩增产物为265 bp。反应条件：94℃预变性5分钟，94℃变性1分钟，56℃退火45秒，72℃延伸30秒，共32个循环，最后延伸7分钟。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳，凝胶图像分析仪作条带密度扫描。结果以目的基因和βactin条带灰度值比值表示。

    Western blot 检测

    收集对照组和40 μmol/L大黄素作用12、24、48小时后的HL60/ADR细胞，用PBS洗涤后加细胞裂解液提取总蛋白，经紫外分光光度仪（Beckman DU640）定量后，取各组等量总蛋白进行12％ SDS聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳，电转移至NC膜上；膜用封闭液封闭1小时，加鼠抗人Bcl2单克隆抗体、鼠抗人cMyc单克隆抗体、鼠抗人caspase3前体单克隆抗体及兔抗人βactin单克隆抗体(Santa Cruz公司产品)，4℃过夜，TBS洗膜后加辣根过氧化物酶偶联的兔抗鼠或羊抗兔IgG抗体,于室温孵育1小时，洗膜后显色。检测过程参照KPL公司蛋白检测试剂盒说明书进行。

    统计学处理

    采用SPSS 11.5软件包进行统计学处理。单因素方差分析比较各组间差异,结果以均数±标准差（±SD）表示。

    结    果

    大黄素对HL60/ADR细胞增殖的抑制作用

    不同浓度大黄素在不同作用时间对HL60/ADR细胞增殖具有明显抑制作用，并呈时间和浓度依赖性，浓度越高、作用时间越长，细胞增殖抑制作用越明显（图1）。大黄素对HL60/ADR集落形成亦具有明显抑制作用，IC50值为5.79 μmol/L（表1）。

    线粒体跨膜电位的变化

    药物作用12小时后，对照组线粒体跨膜电位下降的细胞数很少，占0.51%； 20 μmol/L、40 μmol/L组分别为5.47%、15.90%；80 μmol/L组线粒体跨膜电位下降的细胞数明显增多，占 52.44%（图2）。

    早期凋亡细胞的比率

    大黄素作用HL60/ADR 12小时即可以检测到早期凋亡细胞,20、40 μmol/L药物组凋亡率为8.05%、23.70%, 80 μmol/L作用组的凋亡率最高，达到35.01%,而对照组仅2.12%（图3）。

    Caspase3酶活性

    大黄素作用24小时对照组caspase3酶活性增高细胞数较少，占(2.30±0.38)%， 20、40和80 μmol/L组细胞caspase3酶活性依次增高，增高细胞数分别为（14.60±1.51）%、（27.12±5.56）%和（70.79±1.60）%，各加药组与对照组比较差异具有显著性（p<0.005）（图4）。

    晚期凋亡细胞的比率

    大黄素作用细胞 48小时后，对照组仅偶见棕褐色晚期凋亡细胞，占(0.37±0.15)%。20、40、80 μmol/L加药组均可见数量不等的棕褐色凋亡细胞，凋亡率分别为(10.47±1.08)%、(39.90±1.48)%和(60.73±1.80)%，与对照组比较均有显著性差异（p<0.005）。

    细胞周期分析

    20、40、80 μmol/L大黄素作用HL60/ADR 48小时后,各组均可检测到亚二倍体峰(凋亡峰),随药物浓度增加,细胞凋亡率也相应增高, 3个加药组凋亡率分别为（8.05±0.45）%、（31.33±2.32）%和（48.57±6.43）%，80 μmol/L作用组48小时最高凋亡率可达到55.72%(图5)。与未加药对照组比较，40、80 μmol/L药物作用组G0/G1期细胞增多（p<0.01）, G2/M期细胞减少（p<0.01），20 μmol/L 药物组细胞周期的细胞数与对照组相比差异无显著性（p> 0.05 ）(表2)。

    大黄素对bcl2、cmyc mRNA和Bcl2、cMyc、caspase3前体蛋白表达的影响

    大黄素对HL60/ADR  bcl2、cmyc mRNA和Bcl2、cmyc、caspase3前体蛋白表达的影响呈时间依赖性，bcl2 mRNA、Bcl2蛋白表达水平在药物作用12小时后即明显低于对照组（p<0.01），作用时间越长，降低水平越显著；而cmyc mRNA和蛋白表达12小时作用组与对照组比较差异无显著性(p> 0.05), 作用24小时后表达水平开始明显降低（p<0.01）， 48小时作用组降低更明显。caspase3前体蛋白表达水平在大黄素作用24小时后明显低于对照组（p<0.01）（图6、图7）。

    讨    论

    白血病多药耐药（multidrug resistence,MDR）是指白血病细胞对结构、功能和杀伤机制不同的不同种药物产生耐受，一旦细胞对某种药物产生耐受，即可以对多种其它药物耐受，是造成临床白血病患者化疗失败的主要原因之一。目前应用药物进行白血病MDR的研究报道较常见，如环孢素A、维拉帕米、蛋 白激酶C类抑制剂、氯丙嗪等，由于存在价格昂贵、毒副作用大、不宜长期应用等缺点限制了在临床上的广泛使用。我国学者应用浙贝母碱［7］、汉防己甲素［8］、三氧化二砷［9］等传统中药进行抗白血病MDR的研究已取得了可喜成绩。大黄素是从多种中药中提取的一种蒽醌类单体化合物，其抗肿瘤活性已被国内外学者所证实，Pecere等［1］通过体内外研究表明，大黄素能够对神经外胚层肿瘤选择性地产生毒性作用，抑制肿瘤细胞生长。Wang等［2］研究发现，大黄素是人肺腺癌细胞系CL5 Cyt P450 1A1和1B1 mRNA及蛋白质表达的诱导剂，而Cyt P450表达上调，提示线粒体PT通道开放，可导致CytC释放，引发肿瘤细胞凋亡效应。将大黄素作用于白血病MDR细胞及相应分子机理研究却未见报道，针对凋亡抑制是MDR发生机制中的一个重要原因，本研究选择阿霉素诱导的多药耐药相关蛋白（multidrug resistenceassociated protein ,MRP）高表达的人白血病细胞株HL60/ADR作为研究对象，探讨大黄素对HL60/ADR细胞增殖及凋亡的影响，并分析其中可能涉及的作用机制，为该药今后临床应用提供理论基础。

    本研究结果表明，大黄素能够明显抑制HL60/ADR细胞增殖，呈时效和量效关系，较低浓度大黄素即可以抑制HL60/ADR细胞集落形成，IC50值为5.79 μmol/L。大黄素作用48小时后，细胞周期分析可见典型的亚二倍体峰（凋亡峰），G0/G1期细胞比例明显高于对照组。以上结果提示，大黄素抑制HL60/ADR细胞增殖可能是通过抑制DNA合成，主要作用于HL60/ADR细胞的G0/G1期，从而阻滞细胞周期的进程来实现。集落形成试验结果进一步显示大黄素的细胞增殖抑制效应，同时也表明其对HL60/ADR细胞可能具有较强的抑制作用，提示该药具备较好的临床抗肿瘤应用前景。通过细胞凋亡检测发现，大黄素作用12小时，线粒体跨膜电位降低的细胞数明显增加； Annexin V FITC/PI 法证实，大黄素可以诱导早期细胞凋亡，作用24小时后caspase3酶活性升高的细胞数显著增多；作用48小时，TUNEL 法从形态学观察到典型的晚期凋亡细胞，并且细胞凋亡率呈现明显剂量依赖性，药物浓度越高，细胞凋亡率也越高，这说明大黄素能够有效诱导HL60/ADR细胞凋亡。

    细胞凋亡是由多因素引起、多分子参与的复杂过程。cmyc是一个重要的细胞原癌基因，主要通过基因扩增和染色体易位重排激活，表达产物为分子量约67 kD的序列特异性DNA结合蛋白，与细胞增殖、分化、凋亡密切相关，在髓性白血病细胞中存在高表达，本课题组前期研究发现，cmyc在大黄素诱导HL60细胞凋亡过程中发挥重要作用［5］。bcl2是一个重要的抗凋亡基因，又是目前已知的与肿瘤耐药密切相关的耐药基因，临床上大部分血液系统肿瘤存在bcl2的高表达，从而导致患者对放疗和化疗产生耐受。bcl2位于线粒体内膜，在维持线粒体跨膜电位中发挥重要作用，可通过干扰Cyt C的释放，阻止caspase的激活。线粒体依赖性凋亡通路是细胞凋亡的主要途径之一，而细胞凋亡主要途径的中心环节就是caspase 的级联激活反应，其中caspase3是该级联反应的关键效应分子［10］。Asakura等［11］认为MDR细胞具有对线粒体损伤的敏感性，直接损伤线粒体将诱导细胞凋亡。本研究结果显示，cmyc和 bcl2均高表达的HL60/ADR细胞在大黄素作用后，两种基因的mRNA和蛋白表达水平均有明显的下降，呈时间依赖性，作用12小时即可观察到线粒体跨膜电位下降细胞数明显增加，bcl2表达水平开始下调，作用24小时cmyc、caspase3前体表达下调，作用时间越长，表达水平越低，这表明大黄素可通过抑制bcl2、cmyc的表达，促进caspase3的剪切活化，从而诱导HL60/ADR细胞凋亡，线粒体途径可能参与了该过程。

【参考文献】  1Pecere T, Gazzola MV, Mucignat C, et al. Aloneemodin is a new type of anticancer agent with selective activity against neuroectodermal tumors. Cancer Res, 2000;60:2800-2804

2Wang HW, Chen TL, Yang PC, et al. Induction of cytochromes P450 1A1 and 1B1 by emodin in human lung adenocarcinoma cell CL5. Drug Metab Dispos, 2001;29:1229-1235

3Kuo PL, Lin TC, Lin CC. The antiproliferative activity of aloneemodin is through P53dependent and P21 dependent apoptotic pathway in human hepatoma cell lines. Life Sci ,2002;71:1879-1892

4Chen HC, Hsieh WT, Chang WC, et al. Aloneemodin induced in vitro G2/M arrest of cell cycle in human promyelocytic leukemia HL60 cells. Food Chem Toxicol,2004;42:1251-1257

5黄绿叶，胡建达，陈鑫基等. cmyc在大黄素抑制HL60细胞增殖及诱导凋亡中的作用.中华血液学杂志,2005;26:348-351

6蒋知俭．医学统计学． 北京：人民卫生出版社，1998:138-140

7胡凯文,郑洪霞,齐静等. 浙贝母碱逆转白血病多药耐药的研究. 中华血液学杂志,1999;20:650-651

8周云,陈宝安,董颖等. 汉防己甲素联合屈洛昔芬逆转K562/A02细胞耐药与诱导凋亡相关性的研究. 中国实验血液学杂志,2004;12:321-323

9许晓巍,许小平,陈少谊等. 三氧化二砷诱导多药耐药白血病细胞K562n/VCR凋亡. 白血病·淋巴瘤,2005;14:4-6

10Zhang Y, Lei XY. Effect of bcl2 antisense oligodeoxynucleotides on drug sensitivity of leukemia cells. Hematol J,2003;4:187-197

11Asakura T, Ohkawa K. Chemotherapeutic agents that induce mitochondrial apoptosis . Curr Cancer Drug Targets, 2004;4:577-590