B淋巴细胞肿瘤患者胸腺近期的输出功能

作者：李扬秋，吴秀丽，杨力建，陈少华，耿素霞    作者单位：暨南大学医学院血液病研究所 广州510632

【摘要】  本研究了解B细胞肿瘤患者胸腺近期输出naive T细胞的水平，以评价其T细胞免疫潜能。利用实时定量PCR（TaqMan）方法检测61例B细胞肿瘤患者（成人BALL 20例，儿童BALL 6例，BCLL 4例，BNHL 17例，MM 14例）外周血单个核细胞（PBMNC）中T细胞受体重排删除DNA环（Tcell receptor rearrangement excision circles, TREC）的含量，并根据外周血中CD3阳性率计算CD3细胞中TREC水平。5例ALLCR病人和17例正常人外周血作为对照。实验结果显示，正常人外周血中TREC拷贝数为3.76±3.42/1 000 PBMNC和5.87±4.96 /1 000 CD3+细胞，而各B细胞肿瘤组的TREC水平均显著低于正常人水平，其TREC水平在成人BALL为0.53±1.52拷贝/1 000 PBMNC和2.01±3.93拷贝/1 000 CD3+细胞（p=0.0005和p=0.0123），在BCLL为0.11±0.15拷贝/1 000 PBMNC，0.23±0.27拷贝/1 000 CD3+细胞（p=0.0015和p=0.0381），在BNHL为0.71±1.34拷贝/1 000 PBMNC（p=0.0017），在MM为0.53±0.90拷贝/1 000 PBMNC（p=0.0018）。ALLCR组TREC水平同样低于正常人水平，儿童BALL组TREC水平明显高于成人组。结论：各类B细胞肿瘤胸腺近期输出naive T细胞功能均明显降低，个体差异较大，在病人达到完全缓解期时，胸腺近期输出功能仍没有得到恢复，提示对病人有动态观察的必要性。

【关键词】  胸腺近期输出功能

    Thymic Recent Output Function in Patients with Bcell Lymphocytic Malignancies

    LI YangQiu, WU XiuLi, YANG LiJian, CHEN ShaoHua, GENG SuXia, Grzegorz Przybylski1, Christian A. Schmidt1

    Institute of Hematology, Medical College, Jinan University, Guangzhou, 510632, China；1Department  of Hematology and Oncology, ErnstMoritzArndt University Greifswald, Greifswald 17487, Vorpommern, Germany

    Abstract    The aim of the study was to analyze the naive T cell level of thymic recent output in patients with Bcell malignancies, thereby to evaluate the potential Tcell function. Quantitative analysis of  Tcell receptor rearrangcment excision circles (TRECs) in DNA of peripheral blood mononuclear cells from 61 cases of Bcell lymphocytic malignancy (including 20 cases of adult BALL, 6 case of childhood BALL, 4 cases of BCLL, 17 cases of BNHL and 14 cases of  MM) were preformed by realtime PCR (TaqMan), and TREClevel was detected  according to the number of CD3positive cells. 5 case of ALLCR and 17 normal individuals were served as controls. The results showed a dramatic reduction of TREC values in all groups of patients. The mean value of TRECs was 0.53±1.52 copies /1 000 PBMNC and 2.01±3.93 copies /1 000 CD3+cells in adult BALL (p=0.0005, p=0.0123), 0.11±0.15 copies /1 000 PBMNC and 0.23±0.27 copies/1 000 CD3+cells in BCLL (p=0.0015, p=0.0381), 0.71±1.34 copies /1 000 PBMNC in BNHL (p=0.0017), 0.53±0.90 copies /1 000 PBMNC in MM patients (p=0.0018), as compared with 3.76±3.42 copies /1 000 PBMNC and 5.87±4.96 copies/1000 CD3+cells in normal individuals, the TREC level was   significantly decreased  in all groups of Bcell lymphocytic malignancy, as well as in ALLCR group. However, the TREC level in childhood BALL was significant higher than those in adult BALL group. It is  concluded that  the  function of thymic recent outputing naive T cells     in Bcell malignancies significantly decreases, however, the individual difference of thymic output function is obvious. The thymic recent output function can not be recovered during CR phase in patients with Bcell malignancies,  so  that  dynamic analysis of TREC level  is necessary.

    Key words    TREC;  thymic recent output function;  leukemia;  realtime PCR

    J Exp Hematol 2007; 15(5):1023-1027

    血液肿瘤患者细胞免疫功能状况与疾病的预后有着重要的关系，T细胞免疫在对抗肿瘤微小残留病中起关键作用。研究肿瘤患者的T细胞免疫功能状况也是研究特异免疫治疗的一个重要问题。我们的前期研究发现，尽管白血病患者存在细胞免疫功能缺陷，患者体内仍存在特异性抗白血病的T细胞克隆［1，2］，但多数患者却未能使其发挥有效的抗白血病效应，其原因是否在于机体的免疫潜能缺陷。本研究进一步分析B淋巴细胞白血病患者外周血中信号结合T细胞受体重排删除环（signal joint Tcell receptor rearrangement excision  circles, sjTREC，简称TREC），了解胸腺近期输出功能情况，后者是反映机体的细胞免疫潜能的一个最重要指标［3-6］。

    标本收集和处理

    经细胞形态学、细胞组织化学和细胞免疫学确诊的初发未治各类B淋巴细胞肿瘤61例，其中成人B细胞急性淋巴细胞白血病（BALL）20例，男13例，女7例，年龄17-72岁，中位年龄32岁；儿童BALL 6例，男5例，女1例，年龄3-14岁，中位年龄11.5岁； B细胞慢性淋巴细胞白血病（BCLL）4例，男3例，女1例，年龄53-80岁, 中位年龄75岁；B细胞非霍奇金淋巴瘤（BNHL）17例，男12例，女5例，年龄23-67岁，中位年龄47.5岁；多发性骨髓瘤（MM）14例，男12例，女2例，年龄30-76岁, 中位年龄55岁。完全缓解期（CR）ALL病人5例，男3例，女2例，年龄21-35岁，中位年龄31岁；正常人17例，男6例，女11例，年龄25-51岁，中位年龄28岁。收集这些患者和正常人血液样本，肝素抗凝血，外周血单个核细胞采用Ficoll分离法分离，一部分细胞用于检测CD3+细胞阳性率（应用CD3单抗和间接免疫荧光标记方法），一部分细胞按常规方法（酚抽提法）提取DNA。

    TREC的实时定量PCR检测

    引物设计  引物和探针的核苷酸序列与我们已报道的相同［7］。由于TREC是在TCRδ基因进行删除重排时，由在其两侧的δRec和ψJα两个删除片段的内侧重组形成一个环行DNA，即TREC。在扩增该TREC产物时，所设计引物的方向恰好与一般的PCR引物相反［2，5］。

    RAG2TREC标准品的构建  利用2对引物分别扩增所需的RAG2和TREC的基因片段，经序列分析证实后分别将其克隆到TOPO TA 载体上（TOPO TA Cloning Kit，Invitrogen，荷兰），获得表达TREC和RAG2双基因片段的质粒作为标准品［7］。根据凝胶电泳和分光光度计检测结果，将标准品DNA浓度分别调整为107 、106、105、104、103、102、和10/ 2 μl  DNA等7组。

    实时定量PCR（realtime PCR）  每一标本分别进行2次RAG2和2次TREC的检测，总反应体积为25  μl，其中含标准品或100 ng 基因组DNA，0.5 μmol/L各引物，0.2 mmol/L dNTP，1.5 U AmpliTaq Gold， 0.1 μmol/L的 6FAMTAMRA 探针和PCR缓冲液（含4 mmol/L MgCl2）。在95℃变性10分钟后，共进行45循环扩增，每一循环包括95 ℃， 30秒和 64 ℃， 1分钟。反应在ABI PRISM 7700 Sequence Detector（PE公司产品）中进行。反应分别设标准组（7个浓度）、阳性对照（2个平行反应）、阴性对照（2个平行反应）及样品组［7］。

    统计学处理

    各组样本中TREC含量以均数±标准差（±SD）表示，显著性检验用两独立样本t检验，组间比较采用方差分析。

    结    果

    利用2对引物和探针，经实时定量PCR分别扩增标准品，获得了相关性达到0.995以上标准曲线（图1），各样本DNA检测经与标准曲线比对，分析获得样本中RAG2和TREC的绝对拷贝数值，然后根据每个细胞含两个RAG2拷贝的规律，换算成每1 000个细胞中TREC的含量。计算公式为

    n=2×1000×［TRECs(1)+TRECs(2)］ /

    ［RAG2(1)+RAG2(2)］

    而根据免疫荧光检测单个核细胞中CD3+细胞的阳性率，从所检测的单个核细胞中TREC含量计算CD3+细胞中TREC含量，计算公式为

    n=（TRECs/1000 单个核细胞）÷CD3+%

    本研究的结果显示，在17例正常人外周血中TREC的拷贝数为3.76±3.42拷贝/1 000 PBMNC和5.87±4.96拷贝/1 000 CD3+细胞（CD3阳性率为62.32±4.72%）。在B细胞肿瘤病人中，绝大部样本的TREC水平均显著降低，其中个别样本TREC水平很低，甚至检测不到（在至少相当于10 000个T细胞的样本中未能检测到TREC），也有个别样本的TREC水平接近于正常人水平，甚至在换算成每1 000个CD3+细胞中的TREC含量时，其绝对数量高于正常人，此结果显示了在B细胞肿瘤组中TREC水平的明显个体差异（在同一年龄组中）。 20例成人BALL患者 TREC拷贝数为0.53±1.52拷贝/1 000 PBMNC和2.01±3.93拷贝/1 000 CD3+细胞（CD3阳性率为24.72±16.36%），均明显地低于正常人的水平；BCLL、BNHL和MM样本中所检测到的TREC水平也都显著低于正常水平（表1，图2），各组之间TREC水平的比较均无显著性差异（p>0.05）。

    儿童BALL病人的TREC水平（2.28±2.03拷贝/1 000 PBMNC和12.67±9.52拷贝/1 000 CD3+细胞）虽然也略低于正常成人（缺乏儿童正常对照组，未进行显著性比较），但其TREC水平明显高于成人BALL组（表2）。

    5例缓解期病人的TREC水平为0.48±0.74拷贝/1 000 PBMNC，与初发BALL比较，并没有显著性差异（p=0.8835），但明显低于正常人的TREC水平（p=0.0491）。

    讨    论

    20世纪90年代末，对胸腺免疫功能的深入研究提示了成人胸腺仍存在活化T细胞的合成和输出naive（初始型）T细胞的功能［3-6，8］。胸腺近期输出功能是真正代表T细胞增殖能力和潜能的指标。了解胸腺近期输出功能的指标则是定量检测外周血中naive T细胞的数量，而能够作为naive T细胞的标志的则是T细胞受体删除DNA环（TREC）。1998年Douek等［4］首先报道了用检测外周血单个核中TREC水平来评价HIV感染患者T细胞免疫功能状况。TREC是在胸腺中T细胞发育早期TCR基因重排形成T细胞受体α基因过程中删除位于TCRα基因中间的TCRδ基因时，由TCRδ基因两侧的δRec和ψJα两个删除基因片段重组形成的一个环行DNA。它是染色体外的环行删除产物，不随T细胞的进一步分裂而扩增，其含量代表了TCR基因初始重排形成功能性TCR基因时的naive T细胞的含量［4］。利用实时定量PCR分析TREC来定量评价机体胸腺近期输出功能，这一方法已应用于HIV1感染、AIDS和白血病造血干细胞移植后免疫重建的评价［4，8，9］。我们也发现，一些髓性白血病和苯中毒患者近期胸腺输出功能明显降低［7，10］。有关白血病病人胸腺近期输出功能的研究报道甚少，国外仅有报道儿童淋巴细胞白血病病人胸腺近期输出功能的情况［11］。

    本研究在前期建立了实时定量PCR检测TREC水平和分析了髓细胞白血病、苯接触和苯中毒等研究基础上，结合已发现B细胞肿瘤患者外周TCR Vβ亚家族T细胞存在限制性利用和克隆性增殖的情况，进一步分析TREC水平，以期更全面了解B细胞肿瘤患者整体的T细胞免疫状况。结果发现所分析的61例各种类型病人中，绝大多数病人TREC水平都明显降低，只有个别病人的TREC水平在正常人范围内，但总的TREC水平仍然显著低于正常对照组。由于淋巴细胞白血病病人外周血中存在一定数量的白血病细胞，有可能影响检测的结果。为了排除这一影响，本研究通过检测病人外周血单个核细胞中CD3+T细胞的比例，计算出CD3+T细胞相等的情况下，ALL和CLL病人的TREC水平与正常人的比较，通过换算成CD3+T细胞中TREC含量，可以明显纠正了病人外周血单个核细胞中TREC的水平，但比较的结果BALL和BCLL两组病人CD3+T细胞中所含的TREC仍然低于正常对照组，提示病人中胸腺近期输出功能的确低于正常人。本研究仅收集到5例BALL缓解期病人标本，其TREC水平仍处于较低的状态，这主要是化疗药物的抑制作用，提示化疗后病人胸腺近期输出功能的重建还需要一定的时间，故长期随访是本研究需要进一步完善的工作。

    由于胸腺近期输出功能是随着年龄增加而逐渐降低的，一般认为儿童时期胸腺输出功能最强，20-50岁之间TREC水平变化不明显，70岁以上胸腺近期输出功能比较明显降低。本研究在将收集到的6例14岁以下儿童BALL分为一组，与成人BALL比较，其TREC水平明显高于成人组，由于缺乏儿童组正常对照，因此尚不能评价其TREC水平的改变情况。有报道，儿童BALL的TREC水平与正常比较无显著差异［11］，这也许与儿童时期胸腺功能很强，在受损时可能可以迅速恢复的原因有关。

    本研究比较系统地分析了几种B细胞肿瘤中胸腺近期输出功能的变化情况。结果表明，胸腺近期输出功能基本上都明显降低，这也许可以解释为何在病人的外周血中可以检测到抗肿瘤的克隆性增殖T细胞，但却不能发挥其抗微小残留病变的作用，主要是由于其后备力量（naive T细胞）缺乏，未能产生足够数量的抗原特异性T细胞。因为研究的病例数仍较少，因此还需进一步积累资料，以便提供更全面的结果。

【参考文献】  1李扬秋, 汪明春, 杨力建等. 基因扫描分析BCLL的TCR Vβ 亚家族T细胞的表达和克隆性.中国实验血液学杂志，1998; 6:210-213

2黄梅娟, 李扬秋, 陈少华等.BALL病人 TCR Vβ基因谱系和克隆性分析.肿瘤防治研究，2004; 31:320-322

3李扬秋, 韩素芳, 杨力建. 胸腺输出功能的评价手段—T细胞受体重排删除环的定量分析.中国实验血液学杂志，2003; 11:667-672

4Douek DC, McFarland RD, Keiser PH, et al. Changes in thymic function with age and during the treatment of HIV infection. Nature, 1998; 396:690-695

5Bertho JM, Demarquay C, Moulian N, et al. Phenotypic and immunohistological analyses of the human adult thymus: evidence for an active thymus during adult life. Cell Immunol, 1997; 179:30-40

6McFarland RD, Douek DC, Koup RA, et al. Identification of a human recent thymic emigrant phenotype. Proc Natl Acad Sci USA, 2000; 97:4215-4220

7李扬秋, 韩素芳, 杨力建等. 重度苯中毒患者胸腺输出近期功能明显低下.中国实验血液学杂志， 2005; 13:114-117

8Li Y. Recent thymic output function in patients with hematological malignancy. Hematology, 2005; 10:297-305

9Jimenez M, Martinez C, Ercilla G, et al. Clinical factors influencing Tcell receptor excision circle (TRECs) counts following allogeneic stem cell transplantation in adults. Transpl Immunol, 2006; 16:52-59

10耿素霞, 李扬秋, 陈少华等. CML患者外周血初始 T细胞水平和细胞Vβ谱系利用特点.中华血液学杂志，2005; 26:413-416

11Petridou E, Klimentopoulou AE, Moustaki M, et al. Recent thymic emigrants and prognosis in T and Bcell childhood hematopoietic malignancies. Int J Cancer, 2002; 101:74-77