126例急性白血病异常免疫表型分析

作者：贺景娟,李耀华,孙雪静,万岁桂,徐娟,苏力,田丁   

作者单位：首都医科大学宣武医院血液科, 北京 100053

【摘要】  白血病细胞异常免疫表型是区别于正常造血细胞的重要特征之一，也是流式细胞术检测微小残留病的基础。为了了解急性白血病的异常免疫表型特征，本研究采用四色流式细胞术CD45/SSC双参数散点图设门技术对126例急性白血病患者的异常免疫表型进行分析，并初步探讨其在微小残留病检测中的意义。结果显示：约76％的患者可以检测到明确的异常抗原表达，白血病异常免疫表型可分为以下四类：抗原跨系列表达、跨阶段表达、过度表达及缺失表达，其阳性率分别为39％、46％、21％和29％。约11％的患者仅发生了单一的表型异常，其余患者则可以检测到两类或更多的表型异常。结论：在大多数急性白血病患者中可以检测到明确的白血病异常免疫表型，在此基础上应用多参数流式细胞仪可以有效检测微小残留病变。

【关键词】  急性白血病

     Aberrant Immunophenotypes in 126 Patients with Acute Leukemia

    HE JingJuan, LI YaoHua, SUN XueJing, WAN SuiGui, XU Juan, SU Li, TIAN Ding

    Department of Hematology, Xuanwu Hospital of Capital University of Medical Sciences, Beijing, 100053, China

    Abstract    The existence of leukemia aberrant immunophenotypes (LAIP) has been suggested to be a valuable tool for the detection of minimal residual disease (MRD), as they could distinguish leukemic cells from normal hematopoietic progenitors. This study was purposed to analyze the characteristics of LAIP in acute leukemia and further explore the proportion of different types of LAIP in acute leukemia patients.  Flow cytometry (FCM) with four color and CD45/SSC gating were used to detect the antigen expression in samples of bone marrow from 126 patients with acute leukemia.  The results showed that definite LAIP could be detected in about 76% patients. The LAIP could be divided into four groups as crosslineage antigen expression, asynchronous antigen expression, antigen overexpression and antigen lack expression. The percentages of these LAIPs were 39%, 46%, 21% and 29% respectively. About 11% out   of analyzed cases showed the existance of only one aberrant phenotype while two or more of aberrant phenotypes could be detected in majority cases. It is concluded that the  LAIP with four subgroups can be detected in the majority of patients with acute leukemia and  immunophenotyping based on LAIP is applicable for the detection of MRD.

    Key words    acute leukemia; leukemia aberrant immunophenotype; minimal residual disease

    J Exp Hematol 2007; 15(5):1032-1036

    急性白血病是一种克隆性恶性增殖的血液系统疾病，恶性细胞抗原的表达具有很大的异质性。异常表达的抗原不仅在初发的白血病细胞中可以检测到，而且在治疗后达到形态学完全缓解（CR）时，残存的白血病细胞仍保留其初发时的抗原异常表达［1］。白血病细胞的克隆性增殖特征为临床白血病免疫分型诊断及微小残留病（MRD）检测提供了更准确依据。

    白血病细胞上异常表达的抗原称为白血病异常免疫表型（leukemia aberrant immunophenotyping, LAIP）,LAIP是白血病细胞与正常造血细胞相区别的重要特征之一，也是流式细胞术（flow cytometry, FCM）免疫分型诊断及MRD检测的基础。综合文献报道［2-6］，LAIP主要包括以下4种类型：抗原跨系列表达、跨阶段表达、过度表达及缺失表达。本研究采用四色流式细胞术及CD45/SSC双参数散点图设门的方法对126例急性白血病患者进行了全面的异常免疫表型分析，以期对急性白血病的临床诊断及MRD的检测提供帮助。

材料和方法

    病例资料

    126例急性白血病患者来源于宣武医院血液科1999年11月-2006年06月期间的门诊或住院病人，其中男性71例，女性55例，中位年龄46（14-89）岁。所有患者都经骨髓形态学、细胞化学及流式细胞术免疫分型诊断。FCM分型中髓系、淋系列抗原确定标准参照EGIL评分［7］, 形态学诊断及分型标准参见《白血病的诊断及疗效标准》［8］。FAB亚型诊断结果：M1/M2 78例，M4/M5 17例，M6/M7 5例，BALL 17例以及TALL 9例。由于多数急性早幼粒细胞白血病（APL，AMLM3）异常免疫表型不明显［9］，因此未将M3纳入研究范围。

    实验材料

    单克隆抗体  初发急性白血病患者FCM免疫分型检测所需抗体基本资料见表1。流式细胞仪  FACSCalibur型（Becton Dickinson公司产品），功率为15 MW，激光光源采用氩离子气体激光器，波长为488  nm，进行PE、FITC、PerCP等荧光素的检测，另配有小功率半导体激光器，波长为635 nm，进行APC的检测。结合两个物理参数，前向散射光（forward scatter，FSC）及侧向散射光（side scatter, SSC），可进行4色6参数的综合分析。

    实验方法 

    标本处理、单克隆抗体标记  骨髓液直接免疫荧光标记法。采集初发急性白血病患者的骨髓液3-5 ml，肝素抗凝，用PBS，pH值7.2-7.4稀释后调节细胞浓度至（2-5）×107/ml，室温下进行单克隆抗体标记，详见荧光抗体标记说明书。每次检测各种荧光素均设定相应抗体的同型阴性对照。

    初发患者免疫分型抗体组合  免疫分型抗体组合见表2。实验各管均加入CD45PerCP以进行CD45/SSC双参数散点图设门。

    上机检测  每次细胞获取前先用FACScomp自动软件分析标准荧光微球（calibration beads）以校准仪器。样本收集及结果分析均采用CellQuest（version3.2）软件进行。由于白血病样本通常存在异常的散射光特征及较强的自发荧光，部分患者样本在数据获取前须进行条件设置优化：作FSC/SSC二维散点图，调节FSC增益及SSC检测电压，使不同细胞群既能全部显示在散点图内，又可清楚区分，同时调节FSC阈值去除大部分碎片。初诊患者每管收集10 000个细胞。所有检测均采用CD45/SSC双参数散点图框定白血病细胞的位置（设门），再对门内细胞进行各种荧光抗体的分析。设门内细胞大于相应阴性对照20％确定为抗原阳性表达。

    统计学分析 

    采用Epidata 7.0软件两次输入数据并校准，应用STATA 7.0软件包进行统计学分析，本研究中数据假设检验均采用双侧检验，以p<0.05作为显著性检验的标准。

    结    果

    126例初发非M3患者免疫表型分析显示，96例（76％）存在明确LAIP，其中14例（11%）患者仅见单一的LAIP类型，其余患者均可见两类或更多的表型异常。各类异常表型的分布与FAB亚型无明显相关。

    抗原跨系列表达

    49例（39％）患者存在明确的抗原跨系列表达，在伴淋系抗原表达的AML（Ly+ AML）病例中，CD7+ 24例、CD19+ 11例。伴髓系抗原表达的ALL（My+ALL）病例中，CD13+、CD33+和CD117+的例数分别为6、4和2例。在图1上一行的AMLM2患者的流式细胞图中可见髓系幼稚细胞群表达CD33同时又跨系列表达CD7，而下一行的正常对照者图中无CD33/CD7共表达细胞群（图1）。

    Figure 1. Crosslineage antigen expression (CD7+ AMLM2).

    抗原跨阶段表达

    58例（46％）患者可见抗原跨阶段表达,在AML病例以CD34+CD11b+共表达和CD34+CD56+共表达两种异常最多见，跨阶段异常在ALL较少见，仅2例见CD34+CD20+共阳性的异常表型。在图2上一行为AMLM1患者的流式细胞图中可见幼稚髓系细胞群同时表达CD34和CD11b，而下一行为健康对照者图中，无异常表达的细胞群（图2）。

Figure 2. Asynchronous antigen expression (AMLM1).抗原过度表达异常

    27例（21％）患者可见抗原过度表达异常，在AML病例以CD34、CD11b、CD56及CD117的过度表达为主。CD10和CD7分别是BALL和TALL中最常见的过度表达抗原。在图3上一行TALL患者的流式细胞图中可见幼稚淋系细胞群过度表达CD7，而下一行健康对照者图中则无（图3）。

    Figure 3. Antigen overexpression (TALL).

    抗原的缺失表达异常

    37例（29％）AML患者可以检测到抗原的缺失表达异常，以CD13、CD33及HLADR等抗原易见。9例（52.9％） BALL患者可见的CD45表达缺失或明显减弱，1例TALL患者呈CD2表达缺失。图4的上一行为AMLM2患者流式细胞图中幼稚髓系细胞群HLADR表达缺失，而健康对照者图中可见HLADR表达（图4）。

    讨    论

    Foon等［10］于1986年首次在Blood杂志上报道了利用FCM免疫分型方法诊断白血病与淋巴瘤。1997年，Borowitz等［11］首次拟定了利用FCM免疫分型法诊断白血病的诊断标准。近年来，FCM已由当时代表科技潮流的高精仪器变为现在血液系统恶性疾患诊治中不可缺少的检测工具。

    本组126例初发非M3急性白血病患者免疫分型结果显示，约76％的患者初发时存在异常免疫表型，AML与ALL分别为69％和88％。AML异常表型的阳性率略高于Macedo等［12］的报道，可能与对某些异常表型确定标准的差异有关，例如，Macedo等未将CD117+CD15+的抗原组合列入异常表型范围，但我们的经验是，正常骨髓中CD117+CD15+双阳性细胞的比例<0.01%，可以作为一种异常的免疫表型与正常造血细胞相区别。早期报道关于AMLLAIP的数据明显较低，可能与对异常免疫表型的认识不足及标记的荧光抗体较少有关。

    关于各类LAIP的报道存在很大差异。跨系列表达异常的发生率总体在5％-60％，本研究中，Ly+AML的阳性率在34％左右，而My＋ALL则高达71％，病例数较少和不同的人种特点可能是部分原因。AML中发生最多的淋系抗原是CD7，阳性率达到31％，远高于CD19、CD2、CD22等淋系抗原，而且CD7在所有的AML亚型均有表达，后者则仅见于M2亚型，因此CD7在AMLMRD检测中应用的机会最大。同时也说明，在初发AML患者免疫分型标记的抗体谱中，CD7的标记较其它淋系抗原更有意义。在ALL中发生率最高的髓系抗原是CD13，其次分别为CD33和CD117，与相关报道［14,15］不完全一致，他们认为CD13较CD33更有髓系特异性，在My+ALL中CD33的表达更多见。对白血病初发患者进行免疫分型的抗体组合(表2)中，cMPO/cCD3/cCD79a组合和CD7/CD2(13)/CD33最适宜进行跨系列分析。

    抗原跨阶段表达是除M3外AML病例中最常见的表型异常，阳性率在60％左右，而在ALL则较少见。我们的研究发现AML患者中CD34+CD11b+共表达和CD34+CD56+共表达两种异常最多见，这也是很早就得到研究者一致认可的异常抗原表达组合。在表达频率上，这两种组合较Macedo［12］的报道略升高，但值得一提的是，对方病例组的中位年龄明显低于本组病例，可能对此有一定影响。我们的临床工作中，对白血病初发患者进行免疫分型的抗体组合(表2)中的CD19（20）/CD10/CD34、CD11b/CD34/CD117、CD64/CD14/CD117和 CD41/CD61/CD117抗体组合最适宜进行抗原跨阶段异常分析。

    抗原缺失表达异常可以认为是跨阶段表达的另一类型。在AML患者，发生率约30％。CD33缺失最常见，12例M2患者呈CD34+CD13+HLADR+ CD33－的异常表型。在BALL，CD45缺失表达最值得关注，约53％的BALL患者出现了CD45的表达缺失或明显减弱，有助于进一步明确BALL的诊断以及提高MRD检测的特异性。TALL病例缺失表达异常较少见，本组资料仅1例出现CD2表达缺失，呈明显的CD7+CD5+CD2－表型。我们的免疫分型的抗体组合(表2)中的CD13/CD33/CD117最适用于髓系白血病的抗原缺失表达检测。

   Dworzak等［13］报道，约82％-85％的BALL病例可见明显的免疫表型异常，以抗原的荧光强度(fluorescence intensity, FI)异常最多见。本组资料中，19例BALL皆可见明显的表型异常，以抗原过度表达最多见（64％）。但本组BALL病例的另一特点是My+BALL比例明显升高（59％），这对于患者化疗CR后MRD的检测非常有利， BALL病例MRD分析的最大障碍是区分MRD和化疗后恢复期增多的B淋巴祖细胞（hematogones），两者在形态学及免疫表型等方面均不易准确分辨，但利用抗原跨系列表达的特点则可以解决部分问题。在TALL病例，以CD7的过度表达多见（约56％），另可见CD34、CD2以及CD5等的FI异常。本组资料My+TALL比例（约44％）亦明显较高，病例数较少可能是这种差异的主要原因。

    在FCM异常免疫表型分析中，抗原的过度表达异常是较难控制的LAIP类型，主要是这项指标极易受到各种因素的影响，包括FCM的条件设定、标本处理方法以及不同的荧光素标记等。为了使这些影响减到最低，我们严格统一标本处理方法，同种抗体应用同一荧光素标记，每次检测都先用标准荧光微球调节仪器设定以统一检测条件，部分标本加测T细胞抗原CD3/CD4/CD8作为阳性对照以及FSC/SSC、各种荧光素FI值的参考标准。结果表明，抗原的过度表达亦是较常见的LAIP之一，总体发生率约40％。在AML中，CD56、CD34、CD11b、CD13等抗原均可见明显的过度表达；BALL最常见的过度表达抗原为CD10，达到65％。Campana等［16］报道,CD10的过度表达在儿童BALL中最常见，但本组资料中多数成人患者亦显示了同样的结果。CD7的过强表达是TALL病例的重要特征之一，以正常成熟淋巴细胞的抗原FI值做对照，结合CD45/SSC设门框定白血病位置，在CD7/CD5散点图上可以清楚显示出白血病细胞群（见图3）。

    在所有存在明确LAIP的患者中，仅约11％存在单一的LAIP，其他患者均可见两类或以上的异常表型。事实上，我们发现许多患者并非是完全单一的白血病细胞克隆，而是存在两个甚至多个细胞亚克隆，部分病例的多类LAIP并存是由于其多个白血病细胞亚克隆所致。在FCM免疫分型检测中，合适的抗体组合及多色标记对于全面了解患者的LAIP情况、明确区分多种白血病细胞亚克隆及设计最佳的抗体组合进行MRD的随访监测有重要意义。

    总之，我们的研究结果表明，选用多量的单克隆抗体并进行合适的组合，多数急性白血病患者可以找到异常免疫表型，且相当一部分患者可以检测到两种或更多的异常免疫表型。LAIP检测将有助于利用FCM免疫分型方法对CR后患者进行MRD的随访监测。

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8张之南. 白血病的诊断及疗效标准.第二版，北京:科学出版社，1998： 171-182

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10Foon KA, Todd RF. Immunologic classification of leukemia and lymphoma. Blood, 1986; 68:1-31

11Borowitz MJ, Bray R, Gascoyne R, et al. U.S.Canadian consensus recommendations on the immunophenotypic analysis of hematological neoplasia by flow cytometry: data analysis and interrelation. Cytometry, 1997; 30:236-244

12Macedo A, Orfao A, Vidriales MB, et al. Characterization of aberrant phenotypes in acute myeloblastic leukemia. Ann Hematol, 1995, 70:189-194

13Dworzak MN, Fritsch G, Fleischer C, et al. Comparative phenotype mapping of normal vs malignant pediatric Blymphopoiesis unveils leukemiaassociated aberrations. Exp Hematol, 1998; 26:305-313

14Campana D, CoustanSmith E, Minimal residual disease studies by flow cytometry in acute leukemia. Acta Haematol, 2004; 112:8-15

15Venditti A, Maurillo L , Buccisano F, et al. Multidimensional flow cytometry for detection of minimal residual disease in acute myeloid leukemia. Leuk Lymphoma, 2003; 44:445-450

16Campana D, CoustanSmith E. Advances in the immunological monitoring of childhood acute lymphoblastic leukaemia. Best Pract Res Clin Haematol, 2002; 15:1-19