表达脑源性神经营养因子的人多发性骨髓瘤小鼠模型的建立

作者：王雅丹，胡豫，张璐，黄靖，孙春艳    作者单位：华中科技大学同济医学院附属协和医院血液病研究所，武汉 430022

【摘要】  过去的研究证实脑源性神经营养因子（BDNF）在体外具有促进多发性骨髓瘤（MM）细胞增殖并诱导MM血管新生的能力。本研究探讨BDNF/TrkB途径是否为治疗MM的潜在靶点，并比较两种途径建立人MM NOD/SCID小鼠模型的优缺点，为深入探索治疗MM的新靶点奠定基础。选择糖尿病抵抗/重症联合免疫缺陷（NOD/SCID）小鼠，通过皮下注射或尾静脉注射人骨髓瘤细胞株RPMI8226建立两种异体移植动物模型。观察荷瘤后小鼠的生长状态，测量皮下瘤块的体积；荷瘤后3周，每周经眼眶后静脉丛采血，检测血清中人源λ轻链含量、Ca2+浓度和血浆中人源BDNF浓度，并计数红细胞；小鼠死后，采用组织学方法观察瘤细胞的形态特征，流式细胞术检测小鼠外周血和骨髓中人源性CD38＋细胞比例，采用计算机X线数字摄影观察小鼠全身骨密度的改变和骨质破坏情况。结果表明：皮下注射模型的成瘤率高（5/5），具有多种与浆细胞瘤相似的病理学特征，但其骨髓中未检测到MM细胞，血清中钙离子浓度不高，M蛋白浓度升高不明显且未发现溶骨性损害的组织学和影像学证据。尾静脉注射模型成瘤率相对较低（4/7），骨髓中可检测到呈浸润生长的人CD38＋细胞；而且在荷瘤3周后，血清中即可检测到人源M蛋白；随着肿瘤的生长，M蛋白水平、钙离子浓度逐渐升高，并有溶骨性损害的影像学证据。两种模型血浆中人源BDNF的水平亦逐渐升高，9周时浓度分别为（73±11）pg/ml和（105±18）pg/ml。结论：本研究成功建立了两种高表达BDNF的MM荷瘤NOD/SCID小鼠模型，两种模型相互结合应用，为探索MM治疗的新靶点BDNF/TrkB提供了合适的动物模型。

【关键词】  多发性骨髓瘤

     Establishment of Multiple Myeloma Mouse Models Expressing Brain Derived Neurotrophic Factor

    WANG YaDan, HU Yu, ZHANG Lu, HUANG Jing, SUN ChunYan

    Institute of Hematology, Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430022, China

    Abstract    Previous studies have demonstrated the effects of brainderived neurotrophic factor (BDNF) on promoting proliferation of multiple myeloma (MM) cells and inducing angiogenesis in MM in vitro. This study was aimed to  further explore whether BDNF/TrkB pathway is a potential therapeutic target in MM, and to elucidate  the   advantages and disadvantages  of  two ways   developed  for  human myeloma xenograft in animal models.   The models of xenograft tumors were established in the nonobese diabetic /severe combined immunodeficiency (NOD/SCID) mice by subcutaneous  or intravenous  injection of human myeloma cell line RPMI8226. Mice were monitored daily for life state,  and the volume of subcutaneous tumors were measured after inoculation. 3 weeks after inoculation, red  blood cell counts, BDNF level in plasma, human λ light chain   and calcium level in serum of NOD/SCID were detected every two weeks. The histological and cytological examinations were performed to observe pathological  features of tumors. Using flow cytometry to observe the expression of human CD38+ cell in murine blood and bone marrow. The changes of bone density and skeletal lesions were detected by computer radiography.  The  results showed that the subcutaneously injected animal model showed a  high  growth efficiency of RPMI8226 subcutaneous tumors (5/5) and  several pathological features of plasmacytomas. There were neither  obvious increase in λ light chain  and  calcium levels, nor spread of human MM cells to murine bone marrow and no radiological evidence of skeletal lesions. The intravenously injected animal model had relative   low efficiency for growth of tumors (4/7) but MM cells could engraft  and proliferate in murine bone marrow. The human λ light chain could be  detected in serum as early as 3 weeks after inoculation. Myelomabearing mice had high level of λ light chain and  high calcium   in serum and resorption of the murine bone.  Furthermore, the concentrations of BDNF were increased with the tumor growth in both models with （73±11）pg/ml and（105±18）pg/ml in plasma respectively at  9 weeks   after inoculation.  It is concluded that   two appropriate MM xenograft NOD/SCID animal models were established, both of which show high BDNF levels in the plasma. Therefore,  two valuable in vivo systems to explore novel therapeutic target (BDNF/TrkB)  in MM  have been set up successfully.

    Key words    multiple myeloma; animal model; brain derived neurotrophic factor

    J Exp Hematol 2007; 15(5):967-972

    表达脑源性神经营养因子的人多发性骨髓瘤小鼠模型的建立    我们的研究已经证实，脑源性神经营养因子（BDNF）与其高亲合力的受体TrkB结合后，具有诱导多发性骨髓瘤（MM）血管新生的能力并可以在体外诱导MM细胞增殖、迁移［1-5］。为了进一步探索BDNF/TrkB途径是否为治疗MM的潜在靶点、拮抗BDNF/TrkB能否阻碍疾病的发展，需要建立一种合适的MM动物模型。虽然我们已经建立了一种基质胶MM细胞裸鼠模型，但在荷瘤前需给予裸鼠γ射线照射以便抑制B细胞和自然杀伤（NK）细胞的免疫活性, 并且缺少对该肿瘤组织学特征的描述。

    糖尿病抵抗/重症联合免疫缺陷（NOD/SCID）小鼠是免疫缺陷小鼠品系中残留免疫较少的品系之一，它缺乏功能性的T/B细胞和循环补体，并且NK细胞和巨噬细胞功能也存在缺陷［6］，因此常被作为许多正常和恶性人源细胞的移植载体，包括MM细胞株和MM原代细胞［7,8］。国内有关MM动物模型的报道较少，多为皮下种植模型［9］。国外学者虽然应用NOD/SCID小鼠建立的MM模型较为成熟，但并未涉及BDNF的表达。

    在本研究中，我们将高表达BDNF的人MM细胞株RPMI8226通过两种途径种植于NOD/SCID小鼠以建立MM动物模型，比较两种模型的优缺点，并检测其体内BDNF的表达情况，为深入探索BDNF/TrkB途径在MM中的作用奠定基础。

    材料和方法

    试剂

    兔抗人BDNF抗体和兔抗人CD38抗体购于Santa Cruz 生物技术公司，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG和FITC标记的羊抗兔IgG为Pierce公司产品。FITC标记的小鼠抗人CD38或PerCP标记的小鼠抗人CD45单克隆抗体为Becton Dickinson公司产品。淋巴细胞分离液、RPMI 1640培养液购于Gibco公司。BDNF ELISA试剂盒购于R&D公司。

    细胞培养

    人类MM细胞系RPMI 8226细胞购于中国医学科学院基础医学研究所，置于含有10%胎牛血清的RPMI 1640培养液中，在37℃、5％CO2及饱和湿度的培养箱中培养。取经台盼蓝染色鉴定细胞存活率大于95 %并处于对数生长期的细胞进行实验。

    NOD /SCID小鼠的饲养　

    4-6周龄NOD /SCID雄性小鼠20只，购自上海斯莱克实验动物研究所，饲养于SPF级实验室中。饲料经60Co照射，饮用水及垫料均经高压消毒无菌处理。对小鼠的所有操作均在无菌层流条件下进行。

    模型的建立

    取6-8周龄NOD /SCID 鼠，接受300 cGy γ射线照射(放射源60Co 剂量率172 cGy)，照射后24小时内将3×107个RPMI 8226细胞悬于200 μl PBS溶液中，并经过尾静脉注射途径输注于NOD /SCID小鼠体内（7只），以同体积的PBS溶液作阴性对照（4只）；或不经过照射，左后肢皮下注射2×107个RPMI8226细胞（5只），同部位注射PBS溶液作阴性对照（4只）。每日监测小鼠的体重、皮毛、活动情况、有无麻痹瘫痪症状和感染迹象等。经皮下注射的小鼠还需测量皮下瘤块的体积（ab2π/6，a为长径，b为短径）。待小鼠自然死亡，生存时间以种植瘤细胞当天至死亡时的天数计算。

    血液学指标的测定

    荷瘤3周后，每周经眼眶后静脉丛采血350 μl ，单周时不加抗凝剂，4 000 r/min离心5分钟，取血清于 -20℃储存备用，采用比浊法检测血清中人源λ轻链的含量和钙离子浓度；双周时肝素抗凝，计数红细胞后，1 500 r/min离心5分钟，取血浆，-20℃储存备用，采用ELISA法检测血浆中BDNF浓度，剩余血细胞用于流式细胞术分析。

    流式细胞术分析

    取上述剩余血细胞50 μl，加入荧光标记的抗人CD38抗体3.5 μl，4℃避光孵育1小时；加入红细胞裂解液1ml，混匀，避光常温下裂解15分钟；1 500 r/min离心5分钟，弃上清；用PBS 1 ml洗涤，1 000 r/min离心5分钟，弃上清；用300 μl PBS重悬，24小时内上机检测。皮下瘤块取一部分切碎、研磨、用70 μm细胞滤网过滤，制成单细胞悬液，分别与FITC标记的小鼠抗人CD38或PerCP标记的小鼠抗人CD45抗体孵育后进行流式细胞术分析。

    组织学和细胞学分析

    小鼠处死后，取肝、肾、脾、肺、心、皮下瘤块、一侧的股骨和胫骨用4％中性福尔马林固定，10％ EDTA脱钙（仅用于骨组织），石蜡包埋，5 μm切片，进行HE染色。另一侧的股骨和胫骨，用注射器吸取RPMI 1640培养液反复冲洗骨髓腔制成细胞悬液，500 r/min离心5分钟，制成细胞甩片，进行瑞氏姬姆萨染色和抗人CD38抗体免疫组织化学分析；或采用淋巴细胞分离液分离单个核细胞，常规免疫荧光标记，流式细胞术检测骨髓中人源性CD38＋细胞的比例。

    计算机X线摄影

    待小鼠死后，进行计算机X线数字摄影（PHILIPS optimus 65型），观察全身骨密度的改变和骨质破坏情况。

    统计分析

    实验结果以平均值±标准误表示。组间差异分析采用Student′s t 检验，定义p值小于 0.05为具有显著性差异。

    结    果

    NOD/SCID小鼠种植瘤细胞后的生存情况

    皮下注射组，种植瘤细胞27天内（14-27天），所有小鼠均可在注射局部检测到皮下肿瘤，随后出现明显的体重下降，没有明显的感染或瘫痪征象；荷瘤37天开始有小鼠死亡，61天后所有小鼠均死亡；瘤块的平均体积约为410.5 mm3(239.3-632.7 mm3)。尾静脉注射组荷瘤后22天，5只小鼠出现体重下降、竖毛、弓背症状体征；31天开始有小鼠死亡，60天时死亡5只。相应对照组小鼠存活时间均大于80天。

    组织学和细胞学特征

    皮下瘤块的组织学分析显示，肿瘤呈侵袭性生长，侵及周围骨骼肌组织。瘤细胞具有典型的恶性浆细胞的形态特征：核形态不规则，核仁明显，胞浆丰富，可见有丝分裂像；未见坏死区和纤维结缔组织浸润。进一步的流式细胞术分析显示，瘤细胞的表型与RPMI8226细胞相似（CD38+ CD45+）并且表达BDNF抗原（过去的研究证实RPMI8226细胞高表达BDNF［3］）随后，我们应用流式细胞术检测外周血中和骨髓中单个核细胞人源性CD38抗原的表达，结果显示静脉注射组4只小鼠的骨髓中检测到人CD38+细胞，表达率为12.2％-20.4％（图2B），而两组的外周血中和皮下注射组的骨髓中均未检测到，此结果说明在静脉注射的小鼠骨髓中存在人源性MM细胞的生长。骨髓细胞甩片证实了这一结论，可以见到瘤细胞聚集成团，胞核偏向一侧，核旁有淡然区，胞浆丰富，人CD38表达阳性。如图2C、D。

    股骨骨髓形态学分析显示，瘤细胞浸润整个骨髓腔，骨皮质变薄，大部分的骨小梁被破坏和吸收（图2F）。

    在小鼠的肝、脾、肾、肺和心未发现明显的损害。

    荷瘤小鼠X线摄影

    小鼠死后进行计算机X线数字摄影，可以观察到：皮下注射组小鼠左后肢可见瘤块组织影，全身骨骼的密度与对照组相比无明显差异，并且未见骨质破坏的影像学表现（图3B）；静脉注射组4只检测到MM细胞骨髓内生长的小鼠中2只可疑全身骨密度降低，1只的右侧股骨和左侧胫骨可观察到局限性的溶骨损害：骨皮质变薄，髓腔密度降低（图3C）。

    血液学指标的结果

    荷瘤3周后隔周检测小鼠外周血中红细胞数量和血清中λ轻链和钙离子浓度。对照组小鼠外周血中红细胞计数（RBC）波动于(7.6-11.8)×1012/L之间。皮下注射组荷瘤4周，RBC为（9.4±1.1）×1012/L，随着肿瘤的生长缓慢下降，8-9周时下降明显，从(7.6 ±1.7)×1012/L 降至 (4.5±1.5)×1012/L。静脉注射组RBC的降低较皮下注射组更为显著，从4周时的（7.9±1.2）×1012/L 降至9周时的（2.8±0.6）×1012/L（图4）。

    Figure 4. RBC counts of peripheral blood in NOD/SCID mice.      Control  group， n=8（4-9 weeks）. Subcutaneously injected group，n=5（4 weeks）, n=4（6 weeks）, n=3（8 weeks）, n=2（9 weeks）. Tail vein-injected group, n=7（4 weeks）, n=6（6 weeks）, n=5（8 weeks）, n=3（9 weeks）.  *p< 0.01, compared with control group.

    对照组小鼠血清中钙离子浓度为2.19-2.37 mmol/L，皮下注射组血清中钙离子浓度为2.26-2.32  mmol/L，与对照组比较差异无显著性（p＞0.05）。在静脉注射组4只检测到MM细胞骨髓内生长的小鼠血清中，钙离子浓度高于对照组（p＜0.05），且随时间迁移而增加，9周时为2.86±0.11 mmol/L（图5）。

    Figure 5. Serum Ca2+ concentration of NOD/SCID mice.       Control group， n=8（3-9 weeks）. Subcutaneously injected group，n=5（3 weeks）, n=5（5 weeks）, n=4（7 weeks）, n=2（9 weeks）.Tail vein-injected group,  n=7（3 weeks）, n=6（5 weeks）, n=5（7 weeks）, n=3（9 weeks）.  *p< 0.05,    compared with control group.

    RPMI8226细胞分泌λ轻链，故我们用比浊法检测血清中λ轻链的浓度。该检测方法的检测下限为40  μg/ml。由图6可见，静脉注射组荷瘤3周时，血清中λ轻链水平为45±5 μg/ml，其浓度随着肿瘤的生长迅速增加，荷瘤9周浓度为78±4 μg/ml。皮下注射组荷瘤7周、9周λ轻链浓度分别为44±6 μg/ml、 50±5 μg/ml；而荷瘤7周前，血清中未检测到λ轻链，可能因为此时λ轻链的浓度低于检测的下限。对照组血清中始终无λ轻链。

    Figure 6. Serum concentration of M protein in NOD/SCID mice.   Subcutaneously injected group，n=5（3 weeks）, n=5（5 weeks）, n=4（7 weeks）, n=2（9 weeks）. Tail vein-injected group,    n=7（3 weeks）, n=6（5 weeks）, n=5（7 weeks）,n=3（9 weeks）.     *p< 0.05,compared with control group.

    RPMI8226分泌BDNF，故我们用ELISA法检测血浆中BDNF的浓度。检测方法的检测下限为20 pg/ml。由图7可见，静脉注射组荷瘤4周时，血浆中可以检测到BDNF 浓度为54±6 pg/ml，其浓度随着肿瘤的生长迅速增加，荷瘤9周浓度为105±18 pg/ml。皮下注射组荷瘤4周时BDNF浓度为45±12 pg/ml，9周时浓度为73±11  μg/ml，明显低于静脉注射组（p＜0.05）。对照组血清中始终无λ轻链。

   讨    论

    MM是一种恶性浆细胞克隆性疾病，浆细胞在骨髓内异常增殖并分泌单克隆免疫球蛋白（M蛋白），同时伴有破骨细胞的激活而导致相应的溶骨性损害。临床上表现为M蛋白升高、骨髓中瘤细胞浸润、高钙血症、溶骨性损害和贫血［10］。

    本研究首先在NOD/SCID小鼠体内建立了一种人骨髓瘤细胞株RPMI8226皮下种植的动物模型。此模型荷瘤前不需给予γ射线照射，骨髓瘤细胞皮下种植的成瘤率高，且肿瘤表现出浆细胞瘤的多种病理学特征：浸润周围的肌肉组织，具有恶性浆细胞的典型形态特征，并且与源细胞表型相似均高表达CD38、CD45和BDNF。但MM疾病早期并非为一种实体瘤，仅在疾病的晚期部分患者可发展为髓外浆细胞瘤［10］；并且基础研究和前临床研究均表明MM细胞与宿主骨髓微环境的相互作用在MM的发病机制中发挥着主导作用［11］。但此皮下种植模型的骨髓中未检测到MM细胞、血清中钙离子浓度不高、M蛋白浓度升高不明显且未发现溶骨性损害的组织学和影像学证据，因此该模型不能真实地反映MM发病的病理生理过程。

    随后，我们通过尾静脉注射的途径种植MM细胞。少数NOD/SCID小鼠有渗漏现象，即具有低水平的功能性NK细胞。因此在尾静脉注射的模型中，荷瘤前给予低剂量的γ射线照射，以减少对建立肿瘤模型的影响。4只小鼠骨髓中可检测到人CD38＋细胞，说明静脉注射的MM细胞通过血液循环可成功归巢于小鼠骨髓，并呈浸润生长。而且在荷瘤3周后，血清中即可检测到人源M蛋白；随着肿瘤的生长，M蛋白水平、钙离子浓度逐渐升高，并伴进行性贫血。较之皮下注射模型，静脉注射模型能更好地模拟MM的发生发展过程；但其操作过程较复杂，技术要求较高，且成瘤率较低，评估肿瘤生长状态的指标检测要求条件高。

    值得注意的是，两种模型血浆中均存在有人源BDNF的高表达，且与肿瘤负荷密切相关，考虑为小鼠体内增殖的RPMI8226细胞分泌BDNF进入血液循环。此结果与我们过去在MM患者体内的发现相符［2］。且人源性BDNF与小鼠BDNF具有较高的同源性［12］，说明在此两种模型的基础上可以对BDNF/TrkB信号途径进行深入探索。

    另外，临床上MM骨病变主要表现为骨质疏松和溶骨性损害，常见于颅骨、盆骨、脊柱、股骨、肱骨等处，X线检查为其常规检查手段［13］。但适用于人类的X线摄像参数不太适合于小鼠，加之小鼠骨骼的体积比人类小得多，微小的骨损害或轻度的骨质疏松不易被发现，故应用X线检测小鼠MM骨病变的敏感性较低。本研究中，4只骨髓中检测到人CD38＋细胞浸润的小鼠，在影像学检查方面其中2只可疑全身骨密度降低，在1只的右侧股骨和左侧胫骨可观察到微小的溶骨性损害。因此，我们认为评价MM模型是否成功的关键在于骨髓中有否人MM细胞的浸润、血中有否人M蛋白的表达和有否高钙血症，骨损害的影像学和贫血仅作为参考指标；而肿瘤负荷的大小则取决于骨髓中MM细胞的比例和血中M蛋白表达的高低。

    综上所述，本研究成功地建立了高表达BDNF的MM小鼠模型：尾静脉注射模型能较真实地模拟MM发病的病理生理过程，并有可评估肿瘤负荷的指标，为探索MM治疗的新靶点－BDNF/TrkB途径－提供了合适的动物模型；皮下种植模型可在注射局部形成浆细胞实体瘤，该模型具有成瘤率高、操作过程较简单、技术要求较低，观察肿瘤生长较为直观等优点，因此可作为动物实验研究的辅助模型。

【参考文献】1王雅丹，胡豫，孙春艳等. AKT/eNOS信号途径在脑源性神经营养因子诱导内皮细胞血管新生中的作用. 中华血液学杂志，2006，27: 529－533

2胡豫，孙春艳，王雅丹等. 脑源性神经营养因子（BDNF）在多发性骨髓瘤患者血浆中表达增高及意义. 中国实验血液学杂志，2005;13: 104 -109

3孙春艳，胡豫，吴涛等. 脑源性神经营养因子对多发性骨髓瘤血管新生作用的研究. 中华血液学杂志，2005;26: 602-606

4孙春艳，胡豫，吴涛等. 脑源性神经营养因子及其受体在多发性骨髓瘤细胞中的表达及意义. 中华内科杂志， 2005;44: 906-909

5Sun CY, Hu Y, Wang HF, et al. Brainderived neurotrophic factor induce angiogenesis through modulation of matrixdegrading proteases. Chin Med J, 2006;119: 589-595

6Shultz LD, Schweitzer PA, Christianson SW, et al. Multiple defects in innate and adaptive immunologic function in NOD/LtSzscid mice. J Immunol, 1995;154: 180-191

7Huang SY, Tien HF, Su FH, et al. Nonirradiated NOD/SCIDhuman chimeric animal model for primary human multiple myeloma. Am J Pathol, 2004; 164: 747-756

8Mitsiades CS, Mitsiades NS, Bronson RT, et al. Fluorescence imaging of multiple myeloma cells in a clinically relevant SCID/NOD in vivo model: biologic and clinical implications. Canc Res, 2003; 63: 6689-6696

9洑翔科，邓忠彬，朱伟等. 人多发性骨髓瘤荷瘤SCID小鼠模型的建立及其生长特性. 上海实验动物科学, 2004; 24: 230-233

10Zaidi AA， Vesole DH. Multiple myeloma: an old disease with new hope for the future. CA Cancer J Clin, 2001; 51: 273-285

11谭竞, 刘霆, 朱焕玲等.三氧化二砷对多发性骨髓瘤骨髓基质细胞增殖及分泌细胞因子的影响. 中国实验血液学杂志，2006; 14: 258-261

12方秀斌. 神经肽与神经营养因子. 北京:人民卫生出版社.2002: 289-294

13Angtuaco EJ, Fassas AB, Walker R, et al. Multiple myeloma: clinical review and diagnostic imaging. Radiology, 2004; 231: 11 -23