白血病细胞中NF κB调控MDR1基因、P糖蛋白及逆转耐药的研究

作者：王漪*，刘心，张海涛，余敏，王晖    作者单位：西安交通大学医学院第一附属医院血液科， 西安 710061

【摘要】  本研究探讨NFκB调控的血液肿瘤细胞抗凋亡机制中是否有mdr1的参与，并通过对NFκB的抑制希望获得血液肿瘤的耐药逆转，为难治性白血病的治疗探索一条新的道路。取不同终浓度的NFκB抑制剂PDTC作用的，或者同一浓度作用不同时间后的K562/A02细胞，分别用免疫组织化学加计算机图像分析仪方法半定量检测每1份样本中NFκB的活性和Pgp的表达，以及用反转录多聚酶链反应方法半定量检测每2份样本中mdr1的活性，通过统计学来分析mdr1、Pgp的表达是否与NFκB的活化有关。结果表明：随着NFκB抑制剂PDTC作用浓度的不断升高、作用时间的不断延长，K562/A02细胞NFκB/p65的表达不断降低，Pgp和mdr1 mRNA的表达也逐渐降低，而且三因子之间均有显著相关性。结论： 通过对K562/A02细胞高表达的NFκB的抑制可降低该细胞的mdr1 mRNA和Pgp的表达，从而提高血液肿瘤细胞的放化疗敏感性。

【关键词】  PDTC

    NFκB Regulating  Expression of MDR1 Gene and  Pgp to Reverse  Drugresistance in Leukemic Cells

    WANG Yi*, LIU Xin, ZHANG HaiTao, YU Min, WANG Hui

    Department of Hematology,  The First  Affiliated Hospital,  Xi'an Jiaotong University, Xi'an 710061, China

    Abstract    This study was purposed to investigate whether the mdr1 participates in antiapoptotic mechanisms of hematologic malignant cells regulated by NFκB and to explore the reversal effect of inhibiting NFκB  on drugresistance of hematologic malignant cells so as to search a novel way for treatment of refractory leukemia.   NFκB activity and Pgp expression in K562/A02 cells cultured with PDTC in different concentration or different time  were detected  by immunohistochemistry and computerized  picture analysis.  The  mdr1 was detected by reverse transcriptionpolymerase chain reaction, and  the relationship among NFκB , Pgp and mdr1 was analyzed.   The results showed that in K562/A02 cells the  expression of Pgp and mdr1 were positively correlated with NFκB/p65, which showed  the concentration and time dependent  manner. It is concluded the mechanism of NFκB regulating     antiapoptosis in K562/A02 cells has the correlation with the expression of mdr1 and Pgp. The expression of mdr 1 mRNA and Pgp can be reduced through inhibiting NFκB  in K562/A02 cells, so that the sensitivity of chemical therapy can be enchanced on hematologic malignant cells.

    Key words    K562/A02； NFκB； PDTC； PGP； MDR1

    J Exp Hematol 2007; 15(5):950-954

    白血病的多药耐药性是导致化疗失败、疾病复发及难以根治的主要原因，是目前临床上亟待解决的难题之一。新近研究发现mdr1及其产物Pgp高表达是耐药的主要机制。白血病细胞MDR现象就是指白血病细胞mdr1基因及其产物Pgp过度表达导致细胞药物外排增加，降低白血病细胞内化疗药物浓度，白血病细胞由此逃避化疗药物的杀伤而产生耐受现象［1］。因此，应用针对耐药肿瘤细胞Pgp高表达的逆转剂是解决耐药的关键。现研究较多的一类基因调控子NFκB已被证实可调控多种实体瘤（乳腺癌、肝癌、结肠癌等）的mdr1基因表达。本实验通过研究NFκB和mdr1在恶性血液病耐药细胞株中的关系，明确NFκB调控的血液肿瘤细胞抗凋亡机制是否有mdr1的参与，并可提供在恶性血液病耐药这一难题上一种可能的逆转耐药的途径，预期应用此新方法，并与现有的其他方法联合，会在逆转白血病细胞耐药中起显著效果，为进一步提高血液恶性肿瘤的疗效作出贡献。

    材料和方法

    主要试剂

    二硫氨基甲酸酞吡咯烷（Pyrrolidinedithiocarbamic PDTC）购自Alexis Biochemicals公司，先用无血清RPMI 1640培养液配制成10 mmol/L的贮存液，细胞干预前将贮存液用完全培养液稀释成所需浓度。中国实验血液学杂志  J Exp Hematol 2007; 15(5)白血病细胞中NFκB调控MDR1基因、P糖蛋白以及逆转耐药的研究兔抗人NFκB/p65多克隆抗体购自武汉博士德生物工程有限公司。鼠抗人Pgp单克隆抗体购自武汉博士德生物工程有限公司。SABC免疫组织化学试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。TRIZOL reagent购自Invitrogen公司。反转录试剂盒购自MBI公司。2×PCR TaqMIX购自北京天为时代科技有限公司。

    PCR引物

    由Primer引物设计软件设计，上海生物工程有限公司合成。 mdr1有义链引物： 5′CAAAGGAGGCCAACATAC3′（3870-3887）； mdr1反义链引物： 5′CTGCCATTCTGAAACACC3′（4156-4173）   扩增片段为304 bp。β2微球蛋白（β2MG）有义链引物： 5′TCCAGCGTACTCCAAAGA3′（122-139）； β2微球蛋白（β2MG）反义链引物： 5′ACGGCAGGCATACTCATC3′（346-363）扩增片段为242 bp。

    细胞株及细胞培养

    K562/A02耐药细胞株购自中国医学科学院血液学研究所药理室。K562/A02细胞在含1 μg /ml阿霉素的培养液中培养，实验前2周在无阿霉素的培养液中培养。所有的细胞株都在含体积分数为10%的小牛血清的RPMI 1640培养液中，于37℃、5% CO2饱和湿度孵箱中培养。实验时均采用对数生长期细胞。不同浓度组加入含PDTC不同浓度的完全培养液培养12小时，不同时间组加入含10 μmol/L  PDTC的完全培养液培养不同时间。并设未经干预的为空白对照。

    NFκB/p65、Pgp免疫化学染色图像分析

    NFκB/p65和Pgp的检测按SABC试剂盒说明书进行。以未经复染的细胞滴片为分析对象，由同一个观察者在每张细胞滴片中随机选取6个高倍视野（×400），总共至少100个细胞，应用图像分析仪，确定灰度后，NFκB/p65染色片对每个视野的细胞进行灰度值检测，Pgp染色片对每个视野的细胞浆进行灰度值检测。灰度值越高，表达量越低。

    mdr1 RTPCR检测

    总RNA的抽提、RNA逆转录及PCR反应按试剂盒说明书操作。PCR扩增反应产物进行电泳，电泳条带深浅通过扫描后灰度分析，进行目的基因表达的半定量分析，以mdr1 cDNA/β2MG cDNA的灰度比值评价mdr1mRNA的表达水平。灰度值越高，PCR产物越多。

    统计学方法

    全部数据经SPSS 11.5统计软件进行统计分析，数据用均数±标准差（±SD）表示。多组间比较采用方差分析，两变量的相关程度用Pearson直线相关分析法分析。以双侧α=0.05为显著性检验水准。

    结    果

    K562/A02细胞经不同浓度PDTC作用12小时后，在P值为0.05水平上，除了个别相邻两组之间没有显著性差别外，其余各组之间NFκB/p65、Pgp 、mdr1/β2MG的灰度值都有显著性差别。而且根据均数可知，浓度较高的一组NFκB/p65、Pgp的灰度值高于浓度较低的一组，mdr1/β2MG的灰度值低于浓度较低的一组，也就是NFκB/p65、Pgp、mdr1mRNA的表达量低于浓度较低的一组（表1、图1）。众所周知，Pgp表达受mdr1 mRNA的编码，且两者的表达有一致性。本实验不同浓度组中两因子的Pearson直线相关分析，Pgp的表达和mdr1mRNA的表达呈负相关，但Pgp的灰度值越大代表表达量越低，而mdr1灰度值越大代表表达量越高，所以两者的表达是正相关(表2）。

    经Pearson直线相关分析法分析，不同浓度组中，K562/A02细胞中NFκB/p65的表达和Pgp的表达呈正相关，和mdr1mRNA的表达呈负相关，但NFκB/p65和Pgp的灰度值越大代表表达量越低，而mdr1灰度值越大代表表达量越高，所以K562/A02细胞中NFκB/p65的表达和mdr1 mRNA的表达、Pgp的表达均呈正相关，结合多组间方差检验的显著性差异可知，由于NFκB抑制剂PDTC作用浓度的增加，随着NFκB/p65表达的不断减少，Pgp和mdr1 mRNA的表达也在逐渐降低（表2）。

    K562/A02细胞经10 μmol/L PDTC作用不同时间后，在p值为0.05水平上，除了个别相邻两组之间没有显著性差别外，其余各组之间NFκB/p65、Pgp 、mdr1/β2MG的灰度值都有显著性差别。而且根据均数可知，作用时间较长一组NFκB/p65、Pgp的灰度值高于作用时间较短的一组，mdr1/β2MG的灰度值低于作用时间较短的一组，也就是作用时间较长一组NFκB/p65、Pgp、mdr1mRNA的表达量低于作用时间较短的一组（表3、图2）。

    Figure 2.  Gel electrophoresis of mdr1 in K562/A02 cells treated with PDTC of different time. M: DNA marker.  Lane 1: group 1. Lane 2: group 2. Lane 3: group 3. Lane 4: group 4.

    同理，不同时间组中，经Pearson直线相关分析法分析，K562/A02细胞中NFκB/p65的表达和mdr1 mRNA的表达、Pgp的表达也均呈正相关，而且结合多组间方差检验的显著性差异可知，由于NFκB抑制剂PDTC作用时间的延长，随着NFκB/p65表达的不断减少，Pgp和mdr1 mRNA的表达也在逐渐降低（表4）。

    讨    论

    随着化疗方案的改进、支持治疗的加强以及干细胞移植技术的广泛应用，白血病的治疗效果已明显改善。然而，多药耐药性的产生则成为目前部分白血病患者不能获得缓解，或缓解后复发的主要原因。国内外许多学者通过在体外用药物诱导耐药细胞和建立耐药表型动物模型，已发现多种耐药机制： ①各种膜糖蛋白的外排泵作用引起细胞内药物浓度下降，包括mdr1基因编码的Pgp［2］、MDR相关蛋白MRP［3］、P110巨大拱形蛋白LRP［4］、乳腺癌耐药相关蛋白BCRP［5］；②酶系统的作用，包括TOPⅡα表达下降［6］，药物代谢酶系统P450、GST、GSH、GSHPX、SOD表达增高，此外，还有DNA损伤修复酶、DNA聚合酶、O6烷基鸟苷DNA烷基转移酶以及热休克蛋白的改变等［7］；③激素受体量和亲和力的改变；④凋亡机制的修饰［8］。在血液肿瘤中，已被证实的最重要的多药耐药机制是mdr1 mRNA以及其产物Pgp的高表达，本实验即是通过探讨一条新的途径抑制mdr1，实现逆转耐药。

    核因子κB（nuclear factor kappa B，NFκB）是一类能与多种基因启动子或增强子部位κB位点发生特异性结合并促进其转录的蛋白质。它可调控多种基因，如细胞因子、黏附分子、趋化因子、免疫因子、氧化应激相关酶、转录因子等。因而，它可以发挥多种生物学功能，包括参与炎症免疫反应，调节细胞的凋亡，自身的转录，细胞周期调控，肿瘤的发生及耐药等。Ogretmen等［9］证明，在MCF7细胞中NFκB可调控人mdr1启动子活性。并有报道在鼠肝癌细胞中胰岛素诱导的mdr1的表达是被NFκB介导的。最近有文章报道NFκB参与了肝细胞中TNFa诱导的mdr1的表达［10-12］。另有报道，对NFκB活性的抑制，减少了mdr1的表达，增敏了结肠癌细胞对柔红霉素的敏感性。这一结果通过调控mdr1基因的表达提供了NFκB和化疗耐受之间的一个新的联系。但这一机制在白血病和淋巴瘤中是否存在仍需进一步证实。

    本研究针对NFκB是一种氧敏感转录因子，能够直接被活性氧介质（reactive oxygen species，ROS）激活这一特点［13］，选择抗氧化剂二硫氨基甲酸酞吡咯烷（PDTC）抑制NFκB的活化。Lauzurica等［14］证实，NFκB抑制剂PDTC能阻止IκB的降解，同时也可以阻碍NFκB的P65、P50亚基向细胞核的转移，从而发挥抗NFκB的作用。

    本实验发现，当PDTC作用于NFκB时，mdr1、Pgp与NFκB呈正相关，即随着作用浓度的增加或作用时间的延长，mdr1mRNA、Pgp的表达也在逐渐减弱。Bentires等［15］证实，多药耐药基因（mdr1）启动区域的第一外显子包含1个纯化的NFκB结合序列(5'CCTTTCGGGG3')，而NFκB也的确能够激活连接mdr1启动子的报告基因转录。由此可见，在白血病耐药细胞株K562/A02中NFκB可以激活mdr1从而使pgp表达增加，pgp通过自身膜蛋白泵作用外排多种化疗药物，减少肿瘤药物的吸收引起耐药。但是否存在一个PDTC最适的作用浓度和时间，使其调控mdr1基因的作用最强，该结论还需要作进一步的研究。

    基于以上NFκB调控mdr1的研究，今后我们可以探索利用多种已知作用于NFκB不同激活途径的药物来抑制mdr1，达到影响肿瘤的生存，提高化疗或放疗的敏感性，并同时希望能减轻治疗的毒副作用的目的。

    但是，血液肿瘤的耐药是多因素的，肿瘤细胞可随诱导药物、细胞种类、分化阶段和肿瘤细胞所处的微环境等条件的不同，而表现出不同耐药表型，既可以是某一耐药基因表达，也可以是多种耐药基因同时表达。因此，我们应探索和发现更多新的耐药基因，为血液肿瘤耐药的诊断和治疗提供更多的指标和靶点，以提高诊断准确率和治疗效果。

    根据本实验应用NFκB的抑制剂可以抑制mdr1、Pgp的表达这一结果，是否可以探讨一种或多种药物或方法同时阻断多种耐药机制，从而达到高效逆转耐药的目的，这还有待今后进一步的研究。

【参考文献】  1Flens MJ, Zaman GJ, VanderValk P, et al. Tissue distribution of the multidrug resistance protein. Am J Pathol, 1996; 148: 1237-1247

2Higgins CF. The multidrug resistance Pglycoprotein. Curr Opin Cell Biol, 1993; 5: 684-687

3Grant CE, Valdimarsson G, Hipfner DR, et al. Overexpression of multidrug resistanceassociated protein (MRP) increases resistance to natural product drugs. Cancer Res, 1994; 54: 357-361

4Izquierdo MA, Scheffer GL, Flens MJ, et al. Major vault protein LRPrelated multidrug resistance. Eur J Cancer, 1996; 32A: 979-984

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6Wessel I, Jensen PB, Falck J, et al. Loss of amino acids 1490LysSerLys1492 in the COOHterminal region of topoisomerase Ⅱalpha in human small cell lung cancer cells selected for resistance to etoposide results in an extranuclear enzyme localization. Cancer Res, 1997; 57: 4451-4454

7Volm M. Multidrug resistance and its reversal. Anticancer Res, 1998; 18(4C): 2905-2917

8Hickman JA. Apoptosis and chemotherapy resistance. Eur J Cancer, 1996; 32A: 921-926

9Ogretmen B, Safa AR. Negative regulation of MDR1 promoter activity in MCF7, but not in multidrug resistant MCF7/Adr, cells by crosscoupled NFkappa B/p65 and cFos transcription factors and their interaction with the CAAT region. Biochemistry, 1999; 38:2189-2199

10Ros JE, Schuetz JD, Geuken M, et al. Induction of Mdr1b expression by tumor necrosis factoralpha in rat liver cells is independent of p53 but requires NFkappaB signaling. Hepatology, 2001; 33: 1425-1431

11Um JH, Kang CD, Lee BG, et al. Increased and correlated nuclear factorkappa B and Ku autoantigen activities are associated with development of multidrug resistance. Oncogene, 2001; 20:6048-6056

12Kuo MT, Liu Z, Wei Y, et al. Induction of human MDR1 gene expression by 2acetylaminofluorene is mediated by effectors of the phosphoinositide 3kinase pathway that activate NFkappa B signaling. Oncogene, 2002; 21:1945-1954

13Meyer M, Schreck R, Baeuerde PA. H2O2 and antioxidants have opposite effects on activation of NFkappaB and AP1 in intact cells: AP1 as secondary antioxidant responsive factor. EMBO J, 1993; 12: 2005-2015

14Lauzurica P, MartinezMartinez S, Marazuela M, et al. Pyrrolidine dithiocarbamate protects mice from lethal shock induced by LPS or TNFalpha. Eur J Immunol, 1999; 29: 1890-1900

15BentiresAlj M, Barbu V, Fillet M, et al. NFkappa B transcription factor induces drug resistance through MDR1 expression in cancer cells. Oncogene, 2003; 22: 90-97