天花粉蛋白体外抗人白血病和淋巴瘤细胞的作用机制

　作者：王媛媛，欧阳东云，郑永唐    作者单位：中国科学院研究生院，北京 100039

　【摘要】  本研究的目的是探讨天花粉蛋白(TCS)对人白血病和淋巴瘤细胞系的杀伤作用机制。用台盼蓝染色法检测TCS对细胞生长的影响，应用流式细胞术检测TCS诱导细胞凋亡的情况及对细胞生长周期的影响。结果表明：12.5 μg/ml浓度的TCS可以显著抑制各种白血病细胞系的增殖，但对T淋巴细胞系和巨噬细胞细胞系表现为诱导细胞凋亡的作用，而对B淋巴瘤细胞系则表现为生长抑制效应。通过细胞周期检测发现，TCS可以将B淋巴瘤细胞系细胞阻滞在S期，从而抑制细胞增殖，但对T淋巴细胞系则无明显影响。结论：TCS以不同的作用机制杀伤白血病细胞，根据不同的细胞类型分别表现为诱导细胞凋亡和阻滞细胞生长周期的作用。

　【关键词】  细胞凋亡

    Mechanism of Trichosanthin Against Human Leukemia/Lymphoma Cells In Vitro

    WANG YuanYuan1, 2, OUYANG DongYun1,2, ZHENG YongTang1

    1Key Laboratory of Animal Models and Human Diseases Mechanisms, and Laboratory of Molecular Immunopharmacology, Kunming Institute of Zoology, Chinese Academy of Sciences, Kunming  650223, China; 2Graduate School, the Chinese Academy of Sciences, Beijing 100039, China

    Abstract    The study was aimed to investigate the mechanism of cytotoxic effect of trichosanthin (TCS) on leukemia or lymphoma cell lines. Trypan blue exclusion was used to measure the effect of TCS on cell growth and flow cytometry was used to detect the effects of TCS on cell apoptosis and cell cycle. The results indicated that the TCS could inhibit proliferation of various leukemia/lymphoma cell lines at 12.5 μg/ml  concentration, but the effect of TCS on Tlymphocyte and macrophage cell lines showed inducing cell apoptosis and the effect of TCS on B lymphocyte  cell line showed inhibiting cell growth. Detection  of  the cell cycle revealed  that TCS could arrest B lymphocytes at S phase, but not had this  effect on T lymphocytes at the same condition. It is concluded that  TCS can kill leukemia/lymphoma cells through different mechanisms such as  inducing cell apoptosis or arresting  cell cycle  according to cell types.

    Key words    trichosanthin; apoptosis; cell cycle; leukemia; lymphoma

    J Exp Hematol 2007; 15(4):729-732

    血液系统恶性肿瘤是一类常见病和多发病，发病年龄小，死亡率高，严重危害人类健康。目前的化疗药物存在毒副作用大的弊端，从天然药物中寻找有效的抗肿瘤药物是国内外研究的热点之一。天花粉蛋白(trichosanthin,TCS)是我国创制的为数不多的一类新药之一［1］。TCS是从葫芦科植物栝楼(trichosanthes kirilowii)球根中提取的一种由247个氨基酸组成的Ⅰ型核糖体灭活蛋白(ribosome inactivating Protein, RIP),具有多种生物学和药学活性，包括免疫抑制作用、中期引产、抗肿瘤及抗病毒作用［2，3］。我们还首次发现TCS具有体外抗白血病和淋巴瘤的作用，并且针对不同的细胞系分别表现为直接杀伤细胞和抑制细胞生长的作用，TCS抗HIV1作用可能与其选择性的细胞毒性有关，但具体机制尚不清楚［4，5］。在本研究中，我们检测了TCS对各种白血病和淋巴瘤细胞系的诱导凋亡的作用及对细胞周期的影响，以期发现TCS抗白血病和淋巴瘤的作用机制，探讨其用于治疗血液肿瘤的可行性。

    材料和方法

    天花粉蛋白

    TCS购自上海金山制药厂，从葫芦科植物栝楼（trichosanthes  kirilowii）球根中分离纯化所得。

    试剂

    台盼蓝购自上海化学试剂站(进口分装)。RPMI 1640和新生牛血清均购自Gibco公司。AnnexinV凋亡检测试剂盒购自深圳晶美生物工程有限公司。24孔细胞培养板购自Costar公司。碘化丙锭购自Sigma公司。

    中国实验血液学杂志  J Exp Hematol 2007; 15(4)天花粉蛋白体外抗人白血病和淋巴瘤细胞的作用机制

    细胞

    人Ｔ淋巴细胞系Hut78和Raji由P. Marx博士(California Primate Research Center，University of California，USA)惠赠；Molt4细胞由日本国立卫生研究院筑波医学灵长类研究中心R.Mukai 惠赠；Jurkat、CEM由英国Medical Research Council(MRC)，AIDS Reagent Project惠赠；Daudi细胞购自中国医学科学院血液病研究所；U937细胞购自美国American Type Culture Collection (ATCC)。以上细胞均在含10%新生牛血清的RPMI 1640培养基中培养。

    细胞死亡率的台盼蓝染色法检测

    将2 ml细胞悬液(3×105/ml)接种至24孔平底培养板，分别加入终浓度为12.5、2.5、0.5、0.1 μg/ml的TCS，同时设置不含TCS的空白对照孔。37℃、5％ CO2饱和湿度培养箱中培养72小时后收集细胞，加入0.4%的台盼蓝染色后，在显微镜下用计数板记数死细胞和活细胞并计算其死亡率。

    细胞凋亡的流式细胞术检测

    将2 ml细胞悬液(3×105/ml)接种至24孔平底培养板，分别加入终浓度为12.5、2.5、0.5、0.1  μg/ml的TCS，同时设置不含TCS的空白对照孔。37℃、5％ CO2饱和湿度培养箱中培养72小时后，离心收集细胞，用PBS洗涤2次，加入结合缓冲液重悬细胞，分别加入FITC标记的AnnexinV和PI溶液，上流式细胞仪（Becton Dickinson Calibur）检测。Cell Quest软件进行数据分析，计算细胞凋亡率。

    细胞周期检测

    将2 ml细胞悬液(3×105/ml)接种至24孔平底培养板，加入终浓度为12.5  μg/ml的TCS，同时设置不含TCS的空白对照孔。37℃、5％ CO2饱和湿度培养箱中培养72小时后收集细胞，细胞数调整到1×106/ml。收集的细胞悬液用PBS洗2次，再用70%的冷乙醇在-20℃下固定过夜。用PBS洗涤细胞2次，加入RNase A(10 mg/ml in 1 mol/L TrisCl, pH 7.4) 37℃处理1小时。随后加入碘化丙锭 (100 μg/ml  phosphatebuffered saline, pH 7.4)对细胞进行染色。室温放置1小时后，上流式细胞仪检测［6］，应用Cellquest软件获取数据，Modfit软件分析细胞周期。

    统计学处理

    数据用±SD表示，采用SPSS  11.5统计软件作t检验分析。比较不同处理的参数,以p<0.01表示有显著差异。

    结    果

    天花粉蛋白对各种白血病细胞的杀伤率

    TCS对各种肿瘤细胞系均有一定的杀伤作用，并且呈现出剂量依赖效应，但TCS对不同的细胞系的杀伤作用又有着明显的差异。在相同作用条件下，TCS对T淋巴细胞系细胞 (HUT78、Molt4、Jurkat、CEM)和巨噬细胞系U937细胞的杀伤率较高，而对B淋巴瘤细胞(Raji、Daudi)的杀伤率很低。通过台盼蓝染色发现，TCS对T淋巴细胞系和巨噬细胞系更多地表现为细胞的杀伤作用。在12.5  μg/ml的浓度下，Jurkat细胞的死亡率为(47.57±0.55)%，而相同条件下Raji细胞的死亡率仅为(10.36±0.56)% ，两组结果相比有显著性差异（P<0.01）(图1)，这与我们之前的结果也是相一致的［4］。推测TCS在较高浓度下大量杀死T淋巴细胞系和巨噬细胞系细胞，而对于B细胞系细胞则表现为抑制生长的作用，但产生这种结果的机制还不清楚，为此我们检测了TCS对各种肿瘤细胞系的诱导凋亡作用和对细胞周期的影响。

    天花粉蛋白对各种白血病细胞的诱导凋亡作用

    TCS对各种白血病细胞系均有一定的诱导凋亡作用，且表现为剂量依赖性，但对不同细胞系的敏感程度不同。TCS对T淋巴细胞系和巨噬细胞系细胞可以诱导较多的细胞凋亡。TCS在12.5 μg/ml的浓度下，引起(58.21±1.07)%的Jurkat细胞的凋亡，对U937细胞也有(49.45±1.17)%的细胞凋亡。但在相同条件下，只引起(15.75±0.52)%的Raji细胞凋亡（p<0.01）(图2)。图3为TCS诱导白血病细胞凋亡3次实验中一次细胞流式分析结果，与台盼蓝染色的结果有良好的一致性。天花粉蛋白对Jurkat细胞和Raji细胞的细胞周期的影响    12.5 μg/ml TCS处理Jurkat细胞72小时后，与不加药的对照组比较，细胞周期无明显差异。在相同条件下，TCS处理Raji细胞72小时后，与不加药的对照组比较，细胞被阻滞于S期。TCS处理的Raji细胞有( 67.57±0.94)%处于S期，而对照组细胞只有(48.36±1.78)%处于S期（p<0.01）(图4，附表)，提示TCS抑制Raji细胞的增殖可能是通过将细胞阻滞于细胞周期的S期实现的。

    讨    论

    中医药应用天花粉具有悠久的历史，TCS应用于临床引产和抗肿瘤也有多年的历史，对其临床应用背景很清楚。研究发现，TCS可以用于抗绒癌及葡萄胎的治疗［7］，并对多种肿瘤细胞有显著的杀伤作用，是一种有前途的抗肿瘤药物和免疫毒素弹头［1］。本实验室曾用MTT方法检测发现，多种人的白血病和淋巴瘤细胞系细胞对TCS均十分敏感，TCS对T淋巴细胞和巨噬细胞来源的细胞系细胞有明显的杀伤作用，而对人正常外周血淋巴细胞影响极小，这提示TCS可能对某些白血病细胞和淋巴瘤有一定的治疗价值［4］,随后其他学者也对TCS杀伤白血病和淋巴瘤细胞作用进行了研究［8，9］。为了进一步探讨TCS选择性杀伤某些白血病和淋巴瘤细胞的机制，我们在本研究中检测了TCS对7种不同来源的白血病和淋巴瘤细胞系的杀伤作用。结果表明TCS对T淋巴细胞和巨噬细胞衍生的细胞系的杀伤作用主要是通过诱导细胞凋亡实现的。在12.5  μg/ml的药物浓度下，TCS可以诱导40%以上的各种T淋巴细胞系细胞的凋亡和49.5%的U937细胞凋亡，而对B淋巴瘤细胞则影响较小，仅诱导15%左右的细胞凋亡，但TCS可以明显地抑制B淋巴瘤细胞的生长，提示TCS可能通过其他的机制抑制肿瘤细胞的增殖。我们检测了TCS对Jurkat细胞和Raji细胞的细胞周期的影响。结果显示，在12.5 μg/ml的药物浓度下，TCS可以将Raji细胞阻滞于细胞周期的S期，从而达到抑制细胞生长的作用。但在相同条件下，虽然TCS可以诱导较多的Jurkat细胞凋亡，但对其细胞周期却无明显影响。实验结果提示TCS的抗肿瘤细胞的作用是与细胞类型相关的，并且针对不同类型的细胞有其不同的机制。

    TCS可能通过与受体结合，引起细胞内信号途径的激活或抑制，从而启动细胞内的凋亡信号，最终导致细胞凋亡；或者通过受体介导的方式进入胞质溶胶，发挥其核糖体灭活蛋白的活性；或通过抑制蛋白质的合成，引起细胞生长周期的阻滞，从而抑制细胞的生长［2，10，11］。但这些仅仅是一些推论，而针对不同的细胞，其具体的作用机制并不十分清楚。我们的试验结果证实，即使对于TCS敏感的细胞，其损伤的机制也不同，对于T淋巴细胞系和巨噬细胞来源的U937细胞系的细胞是通过诱导凋亡的方式进行杀伤，并且具有剂量依赖性，而对于B淋巴瘤细胞，虽然台盼蓝染色与凋亡检测均未发现明显的杀伤和诱导凋亡的作用，但我们的结果显示TCS可以使Raji细胞阻滞在S期，从而达到抑制其生长的作用。此外，与通常的化疗药物对于肿瘤细胞和正常细胞两败俱伤的杀伤作用相比，TCS可以选择性的作用于白血病细胞，而对于人的正常外周血淋巴细胞的影响极小，这是其优势。

    从天然动植物中寻找毒副作用小、安全有效的抗肿瘤药物是极有前景的研究领域。TCS通过抑制肿瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞凋亡等途径抑制肿瘤的发生和发展，提示其在抗肿瘤方面具有一定的应用前景。因此，有必要深入对TCS抗肿瘤作用机理进行研究，为TCS的开发和临床应用提供更有力的实验依据。

【参考文献】1汪猷.天花粉蛋白.第二版，北京:科学出版社，2000

2Shaw PC, Lee KM, Wong KB. Recent advances in trichosanthin, a ribosomeinactivating protein with multiple pharmacological properties. Toxicon, 2005; 45:683-689

3Zheng YT, Chan WL, Chan P, et al. Enhancement of the antiherpetic effect of trichosanthin by acyclovir and interferon. FEBS Lett, 2001; 496: 139-142

4Zheng YT, Zhang WF, Ben KL, et al. In vitro immunotoxicity and cytotoxicity of trichosanthin against human normal immunocytes and leukemialymphoma cells. Immunopharmacol Immunotoxicol, 1995;17:69-79

5Wang YY, Ouyang DY, Huang H, et al. Enhanced apoptotic action of trichosanthin in HIV1 infected cells. Biochem Biophys Res Commun, 2005; 331:1075-1080

6黄伟,张瑶珍,周剑锋等. Chk1P2 反义寡核苷酸对顺铂作用下K562 细胞凋亡的影响. 中国实验血液学杂志，2004；12:563-567

7Tsao SW，Yan KT，Yeung HW. Selective killing of choriocarcinoma cells in vitro by trichosanthin, a plant protein purified from root tubers of the Chinese medicinal herb Trichosanthes kirilowii. Toxicon, 1986; 24:831-840

8罗文达，任昌明，朱敏等. 天花粉蛋白诱导NB4人白血病细胞凋亡的研究. 中国实验血液学杂志，2005；13:278-281

9孔梅，柯一保，周美云等. 天花粉蛋白诱发白血病细胞K562凋亡的研究. 实验生物学报，1998；31:233-243

10戴荣禧，徐国江，刘莲英等. 天花粉蛋白对滋养层细胞专一损伤机制的研究.实验生物学报，1993；26：411-427

11毕黎琦，李红军，张玉华. 中药天花粉蛋白对黑色素瘤细胞凋亡及细胞周期的影响.中国中西医结合杂志，1998；18:35-37