活血化瘀通络中药对糖尿病胃轻瘫大鼠胃Cajal间质细胞和间隙连接蛋白43的影响

糖尿病胃轻瘫(diabeticgastroparesis,DGP)是糖尿病(diabeticmelliutus,DM)常见的一种慢性并发症，主要特点为胃动力障碍、胃排空延迟，临床发病率约为50%Kassander等于1958年首先提出“糖尿病胃轻瘫”这一概念并描述了其症状，常见症状包括早饱、恶心、腹胀、呕吐、食欲不振，严重影响患者的生存质量，并可影响血糖的调控，引起营养不良和水电解质紊乱3-,DGP的发病具有复杂的病因、病理特点，目前为止，其确切的发病机制尚未完全明了，尚无良好的治疗药物方法。前期研究证实活血化疲通络中药组方丹参、川芍、水蛙、地龙能明显改善糖尿病胃轻瘫的胃排空率。本研究通过活血化癖通络中药对胃Cajal间质细胞(ICC)和间隙连接蛋白43(Cx43)的影响，进一步探讨其治疗作用及可能作用机制。1材料与方法1.1动物、药物、仪器及试剂1.1.1动物无特定病原体(SpeceficpathogenFree,SPF)级雄性SD大鼠50只，体质量(250120)g。河北医科大学实验动物中心提供(动物合格证编号:1112061)，饲养于河北医科大学中西医结合研究所实验动物中心洁净实验室，实验室温度20一24℃，相对湿度60%一70，昼夜明暗交替时间12/12h。1.1.2药物活血化癖通络中药由丹参、川芍、水蛙、地龙组成，常规煎煮2次，水浴加热蒸发浓缩为每100mL溶液含100g生药，所用生药由河北省中医院中药房提供。1.1.3试剂兔抗大鼠c-Kit多克隆抗体(美国Bio-world生物公司)试剂盒;兔抗大鼠Cx43多克隆抗体(美国Bioworld生物公司)试剂盒。1.1.4仪器Horizon快速血_糖仪[强生(中国)有限公司」;CMIS2011骨髓细胞图像分析系统(重庆海天医疗设备有限公司)。1.2动物模型制备，〕适应性饲养1周后将大鼠随机分为对照组、模型组、中药1组(丹参、川芍组)、中药2组(水蛙、地龙组)、中药3组(丹参、川芍与水蛙、地龙合方组)。造模前禁食12h，除对照组外，其余组大鼠腹腔注射链脉佐菌素(STL)(购自美国Sigma公司)，STZ按1%比例以柠檬酸缓冲液稀释(pH=4.4，冰上配制，现配现用)，剂量为60m郭kg;对照组大鼠腹腔注射等容积0.9%氯化钠注射液。7d后在非禁食情况下采尾静脉血，以HorizonJ决速血糖仪检测血糖，随机血糖,16.7mmol/L为糖尿病造模成功。1.3给药方法造模成功后，实验药物剂量按体表面积换算，中药1组、中药2组、中药3组大鼠分别给予中药1.2(kg·d)灌胃，对照组及模型组给予等容积0.9%氯化钠注射液灌胃，每日1次(10;00左右)，共6周。1.4检测指标应用免疫组织化学法测定胃肌层组织中c一Kit和Cx43表达。1.4.1取材给药6周后，各组大鼠称质量，再禁食16-24h、禁水2h后，按2mL/kg体质量腹腔注射8%异戊巴比妥钠麻醉后，剖开腹腔，结扎责门和幽门，取出整个鼠胃;部分胃组织先用4%多聚甲醛固定，再漂洗、脱水，石蜡包埋，切片。1.4.2染色按试剂盒规定程序操作，滴加特异性标记ICC的兔抗大鼠c一Kit多克隆抗体(美国Bioworld生物公司)和标记Cx43的兔抗大鼠Cx43多克隆抗体(美国Bio-world生物公司)。显色、复染、封片，镜检。1.4.3免疫组织化学法测定胃肌层组织中c一Kit和Cx43表达应用CMIS2011骨髓细胞图像分析系统，C-Kit,Cx43阳性表达水平用平均灰度值表示，灰度值越高其阳性表达水平越低，即细胞内相关蛋白含量越低。1.5统计学方法应用SPSS13.0软件，计量资料正态分布者用均数土标准差表示，方差齐者，组间比较采用单因素方差分析，差别有统计学意义的，进一步两两比较采用SNK法，α=0.05.2结果2.1各组胃肌层组织c一Kit和Cx43表达。2.1.1各组胃肌层组织c-Kit的表达对照组c-Kit阳性细胞分布在胃体和胃窦部环形肌层和纵形肌层之间，集中于环形肌内及附近;与正常对照组比较，模型组、中药各组c一Kit阳性细胞分布密度明显减弱(P<0.05);与模型组比较，中药各组。一Kit阳性细胞分布密度增强(P<0.05);中药组间比较，中药3组较其他2组C一Kit阳性细胞分布密度增强(P<0.05)。见表192.1.2各组胃肌层组织Cx43的表达正常对照组Cx43阳性表达密集分布在胃体和胃窦部环形肌层中，阳性表达强弱与c一Kit阳性表达分布具有一致性;与正常对照组比较，模型组、中药各组Cx43的表达明显减低(P<0.05;与模型组比较，中药各组Cx43的表达升高(P<0.O5);中药组间比较，中药3组较其他2组Cx43的表达升高(P<O.O5)。见表1.3讨论DGP是DM常见的慢性并发症，是以胃动力下降、胃排空延迟、胃节律紊乱等为主要特点的一系列临床症候群，表现为上腹部饱胀、恶心、呕吐和全身症状等。_[世纪四十年代有研究首先报道了糖尿病并发症和胃排空延迟之间的关系，证实糖尿病患者50%以上伴有糖尿病胃轻瘫。目前糖尿病胃轻瘫的发病机制并不明确，认为与以下几方面因素有关:①自主神经及内在神经病变;②高血糖;③胃肠激素变化;④微血管及胃肠平滑肌病变;⑤ICC病变过去一直认为，自主神经病变是糖尿病胃轻瘫的重要发病机制，而近来的研究发现它不能解释糖尿病胃轻瘫通常伴有的胃电起搏功能受损的改变，这种电起搏活动并不依赖肠神经或自主神经信号的输人;ICC是一种存在于胃肠道的特殊细胞，是胃肠道的起搏细胞，能自发产生慢波，慢波决定胃肠平滑肌收缩的节律，是胃肠运动的基础ICC是胃肠道中惟一表达。一Kit的细胞，糖尿病胃轻瘫患者胃ICC的c一kitmRNA表达量减少，导致c-Kit阳性细胞在胃体和胃窦部环形肌层和纵形肌层之间分布密度明显减弱，从而影响ICC正常生物学功能，结构破坏、数量减少，最终发生胃肠电活动紊乱和胃肠运动障碍等。缝隙连接，又称间隙连接、通讯连接，是相邻2个细胞之间的一种特殊膜结构，由位于相邻细胞膜上的2个连接子构成，其蛋白成分称为连接蛋白。缝隙连接蛋白(Cx)是构成细胞间缝隙连接(GJ)通道的基本结构和功能蛋白。Cx43在Cx家族中分布较为广泛，是构成GJ最重要组成成分。相邻细胞间通过间隙连接所介导的细胞间隙连接通讯进行着信息和能量物质的交换，对细胞间信息调控、信号转导等生理过程起着重要的作用。Nemeth等研究显示，Cx43在ICC胞体和细胞突起上表达，从而证实ICC彼此及与平滑肌细胞之间形成间隙连接。消化道平滑肌细胞的收缩与松弛是膜电位周期性去极化和复极化的结果，间隙连接正是传导细胞间运动势能的部位。所有组织细胞间动作电位的扩布和传播通过间隙连接完成，因此它是电活动和代谢反应的偶联点。DGP患者存在ICC网络的异常、超微结构的损伤及其与神经末梢及平滑肌之间缝隙连接的减少。中医学认为久病人络，导致络脉癖滞，血行不畅。我们认为DGP的基本病机为气血阻于胃络，气血阻滞不畅，导致胃运化不利，进而发生胃轻瘫。中药丹参凉血养血活血，川芍行气活血，水蛙、地龙具有通络作用，在临床中应用丹参、川芍、水蛙、地龙活血化癖通络复方治疗DGP取得良好疗效，本研究通过应用活血化癖通络复方及其拆方中药对实验性糖尿病大鼠进行药物干预，观察其对DGP大鼠胃c一Kit和Cx43表达的影响，结果表明，DGP大鼠存在胃c一Kit阳性细胞和Cx43表达减低;中药各组方治疗后可明显提高c一Kit阳性细胞和Cx43的阳性表达，中药活血化疲通络复方优于单纯的活血方和通络方。提示活血化窟通络复方及其拆方中药对糖尿病胃轻瘫大鼠的作用，可能与上调间隙连接蛋白基因表达和改善细胞间隙连接通讯功能有关.参考文献韩刚,李秀钧,田浩明. 2型糖尿病患者的胃动力学变化及相关因素探讨[J].华西医科大学学报,2001,(02):296-299.doi:10.3969/j.issn.1672-173X.2001.02.042.Kassander P. Asymptomatic gastric retention in diabetics(Gastmparesis diabeticorm)[J].Annals of Internal Medicine,1958,(04):797-812.孟宪林,鞠中斌,张丹. 糖尿病胃轻瘫的研究进展[J].河北中医,2002,(09):709-711.doi:10.3969/j.issn.1002-2619.2002.09.059.孙玉凤,陈志强,张江华. 消癥通络中药对糖尿病肾病大鼠胃排空的影响[J].中医杂志,2010,(09):830-832.钟毅,赵志明,陆英杰. 胃肠舒和血流干预药物影响糖尿病胃轻瘫大鼠胃窦壁内神经系统病变的研究[J].中国中医基础医学杂志,2008,(12):903-908.姚东英,刘菲. 糖尿病胃轻瘫发病机制的研究进展[J].国际消化病杂志,2011,(01):16-17,47.doi:10.3969/j.issn.1673-534X.2011.01.005.