幽门螺杆菌培养方法的探讨

　　幽门螺杆菌(Helicobacterpylori,Hp)是定植于人胃豁膜的一种微需氧、螺旋状的革兰阴性菌，从胃载膜分离和培养该菌株是研究Hp最基本的方法，同时又是诊断Hp感染、评价新的诊断方法和疗效、体外筛选抗菌药物等的金标准。但Hp的培养条件要求高，与别的细菌不能在同一房间，以免污染其他细菌。目前国外采用的培养方法和条件很昂贵，不适合用于我国大部分地区的临床Hp耐药的监测。本试验旨在建立一种简便、造价低廉、可靠的Hp培养方法。　　1资料与方法　　1.1临床资料选取2011年1}12月在我院行胃镜检查的患者89例，胃镜检查前1个月内未使用抗生素，患者签署知情同意书。胃镜检查时取胃窦戮膜0.1cmx0.1cm大小的组织2块，1块放人尿素酶试剂盒中检测91块立即放人灭菌的1mlPBS(平衡盐溶液)中保存，4h内接种。尿素酶试验阳性样本再进行Hp培养。89例患者胃豁膜快速尿素酶试验阳性53例，男27例，女26例，年龄18~80岁。　　1.2药品与试剂哥伦比亚琼脂〔友康基业生物科技(北京)有限公司，批号:D05110901习;H.pylori标准株(ATCC-43504);培养添加剂:甲氧节氨嚓陡、多茹菌素、万古霉素仁友康基业生物科技(北京)有限公司，批号:SM1108];脱纤维羊血(广州蕊特生物科技有限公司，批号:110916);M-H琼脂仁友康基业生物科技(北京)有限公司，批号:DM0301];脑心浸液琼脂BHI青岛高科园海博生物技术有限公司);革兰染色液(广东环凯微生物科技有限公司，批号:　　11081101P);幽门螺杆菌快速检测试剂盒(尿素酶试剂盒，福建三明市安信生物技术有限公司，批号:20110801);微生物检测配套试剂(过氧化氢酶试剂盒，广东环凯微生物科技有限公司，批号:11042201P);氧化酶试纸(广东环凯微生物科技有限公司，批号:11070801P)。　　1.3Hp培养将尿素酶试验阳性的胃豁膜标本置于无菌操作台，在PBS中剪碎后倒人培养皿中，立即置人50℃的哥伦比亚一脑心浸液培养基(纯水、哥伦比亚培养基、脑心浸液按1000ml:30g:12g配置，摇匀，121℃高压15min后取出，放人50℃的恒温水浴锅中，按体积加人8%脱纤维绵羊血，备用)和培养添加剂(1瓶添加剂加人500ml的培养基中，1瓶添加剂含万古霉素10mg，三甲氧节氨嚓陡乳酸盐5mg，多勃菌素B2500U)，轻轻摇匀，避免气泡产生。待培养基凝固后将培养皿放人自制的微需氧罐中，密封后放人35℃的恒温培养箱。　　1.4微需氧罐的制备在干燥器底部放人一小杯灭菌纯水和一节蜡烛，罐口用少量凡士林涂抹，干燥器中放人培养皿后点燃蜡烛，立即盖上盖子，等待蜡烛因消耗完氧气熄灭，成为自制的微需氧罐。将微需氧罐放人35℃的恒温培养箱中培养3一Sd。培养箱和无菌操作台均为Hp培养专用。　　1.5Hp标准株的培养标准株从一80℃中取出后立即放人37℃恒温水浴锅，摇晃以迅速解冻，用接种环接种适量菌株于制备好的哥伦比亚培养基上(按1000ml;41g的比例分别加人纯水和哥伦比亚培养基，再加人8%的脱纤维绵羊血)，按原代培养的条件，将平皿放置于微需氧罐中，培养1d，至细菌长出。　　1.6菌种的鉴定　　1.6.1革兰染色法:取出原代培养中长有菌落的培养皿和标准株，在无菌操作台中挑取少量细菌涂于载玻片上，并在火焰上固定，水洗，用结晶紫染色液染色1min，水洗;滴加革兰碘液作用1min，水洗;滴加脱色酒精30s(或滴满整个涂片立即倾去后再滴满，脱色10s，水洗;滴加沙黄复染液，复染1min，待干，镜检。观察被染菌株的颜色:紫色为革兰阳性菌，红色为革兰阴性菌。　　1.6.2幽门螺杆菌快速检测法(尿素酶法):取出微孔药条，滴加1一2滴反应液至药膜完全溶解(呈黄或亮黄色)，用已灭菌的牙签挑取胃镜取出的胃豁膜或培养的菌株置于药液中，在25℃条件下孵育，5min后观察结果:红色或紫色为阳性;黄色或亮黄色为阴性。部分强阳性者放人细菌后马上显色，可立即观察。　　1.6.3氧化酶试纸法:用牙签挑取少量培养的细菌于载玻片上，滴1滴纯化水并用接种环搅拌使其均匀散开，然后用牙签蘸取菌液涂于氧化酶试纸表面，3min内观察试纸颜色变化:红色为阳性;不变色为阴性。　　1.6.4过氧化氢酶法:用牙签挑取少量细菌于载玻片上，滴加3%过氧化氢溶液1滴，30s内观察是否产生气泡:产生气泡为阳性;不产生气泡为阴性。　　以上鉴定中需同时符合尿素酶、氧化酶和过氧化氢酶试验阳性，革兰氏染色为阴性，方可认定为Hpo2结果53例尿素酶试验阳性的胃乳膜标本进行培养，　　3一5d后长出菌落45例，经鉴定均符合以上4种检测方法，Hp培养阳性率为84.9%(45/53)。平板上的Hp菌落呈针尖样大小，透明湿润，直径为0.1一3~。见图1。　　3讨论　　随着抗生素的大量使用，Hp的耐药情况也日趋严重，但目前Hp的培养条件、药敏试验在我国仍难以常规开展川，即使是定期监测也有一定的难度。　　目前我国临床根除性治疗Hp多是按经验用药。所以有必要建立简易可靠的Hp培养方法及药敏试验方法。本实验参考周华等的方法，并进行改良，选用密封的干燥器，用燃烧法去除器皿中的氧气，在密闭的缸中加人小杯灭菌水，以保证培养缸中的湿度。　　Hp在大气和绝对缺氧的环境中都不能生长，表明该试验条件适合Hp生长。结果显示，尿素酶试验阳性的53例患者培养出Hp45例，阳性率为84.9%。提示该方法可考虑用于临床Hp的耐药监测。　　Hp原代培养时对营养要求较高，故在哥伦比亚培养基中需加人一定的脑心浸液，脱纤维绵羊血浓度为8%左右，菌株生长良好。在原代培养时加人一定量的抗生素可以减少杂菌的生长。传代和药敏时污染的可能性小，菌落已经经鉴定和挑选，故可以不加抗生素。Langner等认为，取胃底和胃窦部豁膜进行培养Hp阳性率较高。本文考虑患者的耐受情况只选取胃窦薪膜培养。由于尿素酶是胃肠道、泌尿道细菌感染中常见的酶，故检测结果特异性不高，不能作为诊断Hp感染的金标准。本选用尿素酶试验阳性患者的胃勃膜进行培养，结果阳性率为84.90l0,阳性率较高，可用于临床。为了提高Hp鉴定的特异性，本试验采用4种不同的方法同时鉴定，对均符合4种鉴定结果者方可认定为Hp，该做法也是目前Hp培养和鉴定常用的方法。笔者认为，该方法简单易行，成功较高，为临床的耐药性监测提供了可能。　　参考文献     Wüppenhorst N,Viebahn B,Theile A. Culture and successful eradication of helicobacter pylori from heterotopic gastric mucosa[J].Zeitschrift fur Gastroenterologie,2012,(07):677-679.    周华,徐帆,李平. 自创微需氧罐优选幽门螺杆菌培养与保持条件[J].世界华人消化杂志,2007,(16):1855-1858.doi:10.3969/j.issn.1009-3079.2007.16.016.    Langner M,Machado RS,Patrício FR. Evaluation of gastric histology in children and adolescents with Helicobacter pylori gastritis using the Update Sydney System[J].Arquivos De Gastroenterologia,2009,(04):328-332.    Mégraud F. The most important diagnostic modalities for Helicobacter pylori,now and in the future[J].European Journal of Gastroenterology and Hepatology,2012,(Suppl 1):13-15.