细胞外信号调节激酶1小干扰RNA对肝癌细胞增殖能力的影响

随着对肝细胞癌(HCC)信号通路的逐渐阐明,越来越多的研究发现MAPK信号通路在HCC发生发展过程中起重要作用。其中ERK是MAPK信号通路的关键激酶之一,参与了包括肝细胞在内的多种细胞的增殖、分化、凋亡等病理生理过程。有研究表明,ERK信号转导通路在HCC发生发展过程中常过度活化,且其活化情况与HCC患者预后密切相关[3]。因此,抑制ERK表达可能成为治疗HCC的新靶点。本研究检测ERK1在肝癌细胞株及临床标本来源的肝癌组织中的表达情况,然后利用实验室前期构建的腺病毒介导的细胞外信号调节激酶1小干扰RNA,下调肝癌细胞中ERK1的表达,并观察对其生物学特性的影响及初步探讨可能的作用机制。

材料与方法

一、材料来源

大鼠肝癌细胞株RH35、H4IIE为上海长征医院消化内科实验室前期冻存,大鼠原代肝细胞为采用改良的Se宫len胶原酶灌注法自大鼠肝脏中分离获得,分别置于含10%FBS的RPMI1640培养液、10%FBS的细胞完全培养基(DMEM),在37·C体积分数为0.05的CO2培养箱中培养。12份人肝癌组织标本及配对癌旁组织由上海东方肝胆医院提供,其中癌旁组织为距离癌组织边缘约5cm处获取。雄性BALB/c裸鼠6只,5周龄,体质量为18~20g,SPF级,购于中国科学院上海实验动物中心。AdshERK1、腺病毒介导的阴性对照小干扰RNA(AdshNC,即空白对照病毒)为上海长征医院消化内科实验室前期构建。

二、人肝癌组织中ERK1表达的检测

采用免疫组织化学法。将人肝癌组织制成石蜡切片,二甲苯脱蜡至水,清除内源性过氧化物酶,并用酸修复。封闭30min后,一抗封闭过夜,加二抗。DAB显色,苏木精复染,常规树脂封固,观察ERK1的表达情况。

三、大鼠原代肝细胞和肝癌细胞株中ERK1 mRNA表达的检测

将大鼠原代肝细胞、RH-35、H4IIE细胞按2×105/皿接种于35mm培养皿。72h后收集细胞,以TRIzol试剂盒提取总RNA后,反转录为cDNA,行实时RT PCR检测ERK1的mRNA表达水平。

四、细胞增殖实验

分别将大鼠肝癌细胞株RH35、H4IIE按3×103~5×103/孔分人96孔板,再分别按不同病毒感染复数(MOI)感染病毒AdshNC和AdshERK1,每组设3个复孔,并设空白对照。利用细胞计数试剂盒8(CCK-8)检测细胞增殖能力,每90ul培养液加10u1CCK8,混匀后加人96孔板,在、37℃体积分数为0,05的CO2中放置1h,而后在多功能酶标仪上测定450nm处的吸光度(A)值。连续检测6d,上述实验重复3次。以时间为横轴烈值为纵轴,绘制生长曲线。

五、克隆形成实验

分别将大鼠肝癌细胞株RH35、H4IIE按1×104/皿接种于12孔板培养皿,将病毒AdshNC和AdshERK1分别以不同MOI感染RH35、H4IIE细胞。24h后收集细胞分至35mm的细胞培养皿(400个细胞/皿),每3d换液,培养3~4周直至明显克隆形成,吸去培养皿内的培养液,1×PBS洗2次,用考马斯亮蓝R⒛0染色液染色并摄片观察。

六、流式细胞仪检测

细胞周期分别将大鼠肝癌细胞株RH35、H4IIE以2×105/皿接种于35mm培养皿,并分别将病毒AdshNC和AdshERK1以不同MOI感染RH35、H4IIE细胞。感染72h后,收集细胞并重悬于PBS中,温育后30min,应用流式细胞仪测定细胞周期变化。各组设3个复盘,重复3次,并进行统计学分析。

七、裸鼠皮下成瘤实验

将感染AdshNC或AdshERK1后24h的5×106H4IIE细胞分别接种至同一只小鼠左右两侧腋下,待出现可触及肿瘤后,每周测量肿瘤大小2次,3周后处死小鼠,剥离肿瘤并测肿瘤质量。

八、ERK1及其下游癌基因c-myc的mRNA表达检测将

RH35、H4IIE细胞按2×105/皿接种于35mm培养皿,分别按不同MOI感染病毒AdshNC和AdshERK1,并设空白对照。96h后收集细胞,以TRIzo1试剂盒抽提总RNA后,反转录为cDNA,行实时RT PCR检测ERK1、c-myc在mRNA水平上的表达。

九、统计学分析应用

SPSS11,o统计软件进行数据分析。采用∠检验,P<0,05为差异有统计学意义。

结果

一、人肝癌组织标本中ERK1的表达

12份人肝癌组织及其相应的癌旁组织中,11份人肝癌组织的ERK1表达明显高于癌旁组织,且癌旁组织中ERK1主要表达于胞质,而肝癌组织中人胞核的ERK1 1份人肝癌组织中ERK1显差异。

二、大鼠肝癌细胞株中ERK1mRNA的表达

大鼠原代肝细胞、RH35和H4IIE细胞株的ERK1mRNA表达水平分别为0,016±o,oo3、0.075±0.010和0.458±0,052,后两者均高于前者(∠=13.806、7,715,P均<0,01)。以大鼠原代肝细胞为对照,RH35细胞株ERK1mRNA表达水平增高约4,6倍,H4IIE细胞株ERK1mRNA表达水平增高约28,1倍。

三、AdshERK1抑制肝癌细胞增殖能力的测定

感染AdshERK1第3天,肝癌细胞开始出现明显的生长抑制,呈时间依赖性。感染第5天,AdshERK1组与AdshNC组RH35细胞的A450分别为2,5±o.124、1.538±o.o85.后者与前者相比,RH35细胞生长抑制率达37%,见图2;AdshERK1组与AdshNC组H4IE细胞的A450分别为0,980±0,06o、0.529±0,060。

四、AdshERK1抑制肝癌细胞克隆形成能力的测定感染AdshERK1的肝癌细胞较感染AdshNC的肝癌纟时胞克隆形成能力明显受抑制。RH35细胞中,感染AdshERK1、AdshNC的细胞克隆数分别为(91.300±10,263)、(278,700±25,794)个(r=-11,885,P(0,01),克隆抑制率达7.2%,见图4;H4IIE细胞中,感染AdshERK1、AdshNC的细胞克隆数分别为(17.70O±4,041)、(1O7.000±7,211)个,克隆抑制率达83.5%,见图5。

五、AdshERK1对肝癌细胞周期的影响AdshERK1可明显减少大鼠肝癌细胞中S期细胞比例,引起G0/G1期细胞周期阻滞。RH35细胞中,AdshERK1组G0/G1时相细胞较AdshNC组的增多(89.57%±1,26%比76.77%±0.93%,r=11,676,P(0.01),而S期细胞比例较AdshNC组减少(4,39%±0,85%比18.55%±4,80%,莎=-6.826,P(0.01),见图6。在H4IIE细胞中也观察到类似现象,但差异均无统计学意义(P>0,05)。

六、AdshERK1抑制肿瘤细胞成瘤能力的测定

H4IIE细胞感染AdshNC后7d,小鼠皮下即可触及肿瘤,21d后6只小鼠均可触及肿瘤生长;H4IIE细胞感染AdshERK1后10d,小鼠皮下可触及肿瘤,21d后3只小鼠可触及肿瘤生长,肿瘤质量较AdshNC组显著减少E(0.051±0.074)mg比(0,603±0.284)mg,∠=-5,340,P<0,01]。

七、AdshERK1对ERK1及其下游癌基因c-mγc mRNA水平表达的影响

感染病毒后96h,RH35细胞的AdshNC组与AdshERK1组的ERK1mRNA水平分别为0,114±0,007、0.074±0,074,H4IIE细胞的AdshNC组与AdshERK1组的ERK1mRNA水平分别为0.488±0.026、0.307±0。010,AdshERK1组比AdshNC组的ERK1mRNA表达显著下调(RH35、H4IIE细胞中莎=27.532、11,663,P均(⒍01)。感染病毒后96h,RH-35细胞的AdshNC组与AdshERK1组的下游癌基因⒍9,zγc mRNA水平分别为1,472±0,152、1,020±0,050,H4IIE细胞AdshNC组与AdshERK1组的下游癌基因丿c mRNA水平分别为1.012±0.086、0,697±0,066,~AdshERK1组比AdshNC组的RNA表达同样显著下调(RH—35、H4IIE细胞中莎=7,614、26,951,P均<0.Q1)。ERK信号转导通路参与了细胞的多个病理生理学过程,如正常细胞的增殖、凋亡、周期调控及肿瘤细胞的转移、侵袭、多重耐药等[⒌6]。既往研究表明,ERK信号转导通路在HCC发生发展过程中起着重要作用,其与HCC中增殖细胞核抗原(PCNA)的增殖趋势一致[2]。磷酸化ERK1和ERK2与HCC患者预后密切相关,ERK通路活化的HCC患者比ERK表达阴性患者的预后差E蓟。本研究发现,与癌旁组织及大鼠原代肝细胞相比,肝癌组织与大鼠肝癌细胞株中ERK1表达水平明显上调。综上所述,ERK通路的活化在HCC的发生发展中起重要作用。

近年来,关于基因静默技术的研究成为分子生物学研究领域的新热点,基因静默已被广泛应用于各个领域。其中,RNA小分子干扰是目前应用最多、最广泛的一项基因静默技术。实验室前期研究中,Zhong等成功构建了高效表达ERK1小干扰RNA的腺病毒(AdshERK1),并用胆总管结扎方法或二甲基亚硝胺腹腔注射制各大鼠肝纤维化模型,经尾静脉注射AdshERK1可显著下调体内ERK1的表达,并减轻肝纤维化程度。因此,本研究利用已成功构建的A扎hERK1感染大鼠肝癌细胞株,静默ERK1表达,结果发现肝癌细胞的增殖、克隆形成及皮下成瘤能力均受到显著抑制,说明ERK1小干扰RNA在体内外具有明显抑制肝癌的作用。HCC中ERK通路活化后,刺激细胞周期素D1过度表达,并入胞核,促进细胞分裂。ERK信号通路受到抑制后,肿瘤中细胞分裂也受到抑制,细胞周期阻滞于G0/G1期E丬。Jung等,发现,针对ERK1的小干扰RNA或ERK通路抑制剂U0126抑制ERK通路活性后,血管平滑肌细胞中细胞周期被阻滞于G1期。c-mγc 是ERK信号转导通路下游重要的癌基因,参与细胞周期的调节,在细胞分裂G1期向S期转变过程中起重要作用。c-mγc 的高表达引起细胞无限增殖,与肿瘤的早期复发相关。

本研究中,AdshERK1感染肝癌细胞后96h,⒍彻丿c表达明显下降。ERK1小干扰RNA可导致肝癌细胞G0/G1期细胞数增多,S期细胞数减少。因此推测ERK小干扰RNA可能部分通过降低⒍9,a丿c表达以抑制肿瘤细胞增殖本研究表明,AdshERK1可能通过下调ERK1从而下调其下游肿瘤相关基因⒍9Pa丿c的表达,起到抑制大鼠肝癌细胞株RH35和H4IIE增殖、克隆形成及皮下成瘤能力。故ERK1小干扰RNA可能成为HCC治疗的新手段。

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