磷脂酰肌醇3激酶信号转导通路与Barrett食管发生的实验研究

Barrett食管是慢性胃食管反流病最重要的并发症之一,是食管腺癌的癌前病变,其进展至食管腺癌的概率是普通人群的⒛~125倍,但其发病机制尚未完全明确。磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号转导通路是体内重要的生存通路,过度活化可引起细胞分化异常、过度增殖、抗凋亡及促进肿瘤侵袭和转移等,而细胞分化异常是Barre⒒食管的发病机制之一,因此有必要探讨该通路在Barre⒒食管发生中的具体机制。本研究通过构建Barrett食管的动物模型并检测Barrett食管组织中表皮生长因子受体(EGFR)、Akt、磷酸化Akt、磷酸化mTOR的表达水平,探讨PI3K/Akt/mTOR信号转导通路与Barre仗食管发生的相关性。

材料与方法

一、实验材料及试剂来源

二、8周龄雄性Sprague Dawley大鼠140只,体质量(200±20)g,清洁级,由河北医科大学实验动物中心提供。兔抗EGFR多克隆抗体购自北京中杉金桥生物有限公司,兔抗Akt多克隆抗体、兔抗磷酸化Akt(Ser473)多克隆抗体、兔抗磷酸化mTOR多克隆抗体均购自美国⒏nta cruz公司。

二、动物模型的建立

三、140只大鼠分为6组,其中假手术组10只,单纯铁剂组10只,食管十二指肠端侧吻合组30只,食管十二指肠端侧吻合加铁剂组30只,食管胃十二指肠侧侧吻合组30只,食管胃十二指肠侧侧吻合加铁剂组30只。单纯铁剂组、食管十二指肠端侧吻合加铁剂组、食管胃十二指肠侧侧吻合加铁剂组于术后2周起腹腔注射右旋糖酐铁注射液30m酽kg,每周2次。术后12周每组各处死5只大鼠,32周处死全部大鼠。食管十二指肠端侧吻合术式、食管胃十二指肠侧侧吻合术式均能诱发反流性食管炎、Barrett食管的发生。最后共获得10份正常食管组织、62份反流性食管炎食管组织和34份Barrctt食管组织。

三、免疫组织化学SP法检测

所获食管组织均经切片,常规脱蜡至水,微波修复,温育,加人一抗(1:100~1:15o)、二抗及辣根过氧化物酶标记链霉抗生物素蛋白工作液,DAB显色2~5min,脱水、透明、封固。检测EGFR、Akt、磷酸化Akt和磷酸化mTOR蛋白的表达水平。

四、判定标准

1.大鼠食管黏膜组织病理学诊断:参照Miwa等E1]的标准。

2.肠上皮化生组织:采用阿利新蓝-过碘酸希夫(AB PAS)染色。Barre⒒食管中分泌酸性黏多糖的腺细胞呈蓝色,分泌中性黏多糖的腺细胞呈红色,分泌中性及酸性黏多糖的腺细胞呈紫色。

3,免疫组织化学法的判定和定量:以PBS代替一抗作为阴性对照,棕黄色为阳性。阳性细胞总数<25%为弱阳性(+),25%~50%为中等阳性(++),)50%为强阳性(+++)。根据吕宏升等[2]的免疫组织化学定量分析图像采集方法,并参考Kraan等[3]的免疫组织化学定量分析方法,采用专业图像分析软件Image Pro Plus6,0进行处理,分别挑选高倍视野下的正常食管、反流性食管炎食管和Barrett食管黄染区域作为测量区域,每张切片选取10个视野,检测吸光度(A)值,取其平均值作为蛋白的表达强度。

五、统计学处理

应用SPSS17.0统计软件进行统计分析。数据表示,采用单因素方差分析、SNK两两比较和Kendall′s tau-b非参数相关性分析,P<0,05为差异有统计学意义。

结果

一、大鼠正常食管、反流性食管炎食管和Barrett食管组织中EGFR蛋白的表达EGFR蛋白在正常食管组织中几乎不表达;

EGFR蛋白在反流性食管炎食管组织中表达于细胞膜,呈中等阳性(++);EGFR蛋白在肠上皮化生的Barrett食管组织中表达于细胞膜,呈中等阳性(++)和强阳性(+++),并可见在细胞质和细胞核中明显表达,见图1。EGFR蛋白表达水平在Barrett食管、正常食管和反流性食管炎的食管组织中分别为0.1799±0.0367、0.0277±0.0069、0,0438±0,0o25(F=49,65,P<0,05)。在Barrett食管组织中的表达水平高于正常食管和反流性食管炎(g=4,13、6.79,P均(0,05),在反流性食管炎食管组织中的表达水平高于正常食管(g=4.67,P<0,05)。

二、大鼠正常食管、反流性食管炎食管和Barrett食管组织中Akt蛋白的表达

Akt蛋白在正常食管组织中表达阴性;Akt蛋白在反流性食管炎食管组织中多为弱(+)至中等(++)阳性表达,以细胞质为主,少数位于细胞核内;Akt蛋白在Barrett食管组织中呈中等(++)至强(+++)阳′l±表达,主要见于化生组织,见图2。在Brrett食管组织中的表达水平高于正常食管和反流性食管炎(g=3.56、6,51,P均<0,05),在反流性食管炎食管组织中的表达水平高于正常食管(g=4,29,P<0.05)。

三、大鼠正常食管、反流性食管炎食管和Barre⒒食管组织中磷酸化Akt蛋白的表达

四、磷酸化Akt蛋白主要表达于细胞核及部分细胞质。磷酸化Akt蛋白在正常食管组织中基本不表达;磷酸化Akt蛋白在反流性食管炎食管组织中多为弱(+)至中等(++)阳性表达;磷酸化Akt蛋白在Barrett食管组织中呈中等(++)至强(+++)阳性表达,主要表达于化生组织,见图3。在Barrett食管组织中的表达水平高于正常食管和反流性食管炎(q=3.99、7,68,P均(0,05),在反流性食管炎食管组织中的表达水平高于正常食管(g=4.27,P<0.05)。

四、大鼠正常食管、反流性食管炎食管和Barrett食管组织中磷酸化mTOR蛋白的表达

磷酸化mTOR蛋白主要表达于细胞质及部分细胞膜。磷酸化mTOR蛋白在正常食管组织中基本不表达;磷酸化mTOR蛋白在反流性食管炎食管组织中多为弱(+)至中等(++)阳性表达;磷酸化mTOR蛋白在Barrett食管组织中呈中等(++)至强(+++)阳丿l±表达,主要表达于化生组织,见图4。磷酸化mTOR蛋白表达水平在B盯rett食管、正常食管和反流性食管炎的食管组织中分别为0,1591±0,0275、o.0112±0.0017、0.0674±0.0059(F=15.96,P<0.05)。在Barre仗食管组织中的表达水平高于正常食管和反流性食管炎(g=4,11、5,62,P均<0.05),在反流性食管炎食管组织中的表达水平高于正常食管(g=4.03,P<(0,05)。

五、EGFR、Akt、磷酸化Akt和磷酸化mTOR表达的相关性分析EGFR与Akt、磷酸化Akt的表达相关性较显著(r=0.53、0,68,P均<0,05),EGFR与磷酸化mTOR表达的相关性较小。

讨论

目前,胃食管反流病被认为是Barrett食管最重要的危险因素,酸碱混合反流是胃食管反流病患者最主要的反流形式。为此,本研究制作大鼠混合反流的动物模型以进一步探讨Barrett食管的发生机制。

最常用的Barrett食管动物模型是胃酸和胆汁酸混合反流的食管胃十二指肠侧侧吻合术模型[4]和食管十二指肠端侧吻合术模型曰。单纯碱反流或碱反流联合酸反流是对胃食管反流病和Barrett食管患者造成损伤的主要因素[6],以上2种模型即是通过人为因素造成食管损伤而引发Barrett食管。铁剂通过诱导氧自由基产生,加重炎性反应,引起氧化应激损伤[7],促进Barrett食管及食管腺癌的发生。PI3K可通过激活钙黏蛋白调节肠上皮细胞的分化囵。在培养的食管上皮细胞SKGT4中,结合胆汁酸能诱导黏蛋白的表达,给予PI3K抑制剂后能明显抑制黏蛋白的表达,说明PI3K/Akt参与了肠上皮化生的发生过程。EGFR是PI3K/Akt/mTOR信号通路激活的膜受体,在许多人体肿瘤中有过度表达,如食管癌、胰腺癌、结肠癌等[9]。EGFR的基因扩增在Balre⒒食管一异型增生一食管腺癌的早期阶段起重要作用[l。]。本研究结果提示在反流性食管炎和Barrett食管中即有EGFR的高度激活。Akt的激活对于维持组织分化是必需的。Akt在正常食管一反流性食管炎一Barrett食管一异型增生一食管腺癌中被异常激活,其激活水平与疾病的阶段密切相关,伴高度异型增生的BarKtt食管和食管腺癌中磷酸化Akt的表达较无异型增生的Barrett食管明显升高E11]。

本研究结果发现,在反流性食管炎和Barrett食管组织中Akt及磷酸化Akt蛋白的表达均升高,两者的表达与EGFR的表达具有较好的相关性,故PI3K/Akt信号通路部分由EGFR激活,且参与了Barrett食管的发病过程。胆汁酸可磷酸化mTOR的下游底物从而促进Barrett食管向腺癌方向发展[12]。食管腺癌细胞株SEG1中mTOR及其下游分子p70S6K1的表达升高。因此目前正在研究将血TOR作为食管癌治疗的靶点之一。

本研究结果显示,磷酸化mTOR在反流性食管炎及Barreu食管中异常激活,但其与EGFR的相关性较小。mTOR蛋白在Barrett食管中的表达及其作为靶点治疗疾病的意义尚需进一步研究。本研究发现,反流性食管炎食管、Barre⒒食管中EGFR、Akt、磷酸化Akt、磷酸化mTOR蛋白表达均明显高于正常食管组织,且表达升高的部位主要在肠上皮化生的组织区域。4种蛋白表达水平的联合检测对诊断Barrett食管具有重要意义。通过相关性分析发现,EGFR与Akt、磷酸化Akt的表达存在较好的相关性,可能与EGFR和配体结合后激活PI3K/Akt信号通路有关。而EGFR与磷酸化mTOR之间的相关性较小,推测可能是由于mTOR的表达受更多因素影响,而不仅仅是EGFR信号通路,磷酸化mTOR表达水平的改变在Barre仇食管中的意义还需进一步研究来揭示。本研究证实长期胃十二指肠混合反流所致的大鼠反流性食管炎、Barrett食管组织中存在PI3K/Akt/mTOR信号通路的激活,这种在疾病早期即有高表达的情况,对尽早发现疾病、干预疾病的进展具有重大意义,为临床多靶点治疗疾病提供了理论依据。

参考文献

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