整合素靶向光动力学疗法对胰腺癌细胞的影响

　　光动力学疗法(photodymmic therapy,PDT)治疗恶性肿瘤在近2O余年兴起并不断发展·。与传统疗法相比,PDT治疗能相对特异性地杀伤肿瘤细胞、对健康组织损伤较小、不良反应较少,对于年老体弱、不能接受手术或静脉化学治疗的患者尤为适用。目前,有关PDT对胰腺癌治疗研究的文献报道甚少E刈,而靶向PDT的研究更少。整合素αvβ3在胰腺癌SW1990细胞表面高表达。精氨酸一甘氨酸-天冬氨酸(argininc glycinea-spatic acid,RGD)序列的小分子多肽是整合素αvβ3受体拮抗剂,通过RGD耦联量子点后制成的荧光探针能结合整合素,靶向标记胰腺癌细胞。为了进一步讨论PDT应用于胰腺癌治疗的可能性及其机制,本研究设计合成量子点RGD整合素靶向探针,并以该探针作为新型的光敏剂,探讨靶向PDT对体外胰腺癌细胞增殖、凋亡的影响,为胰腺癌的临床治疗提供一个新的思路。

　　材料与方法

　　一、材料

　　量子点RGD整合素靶向探针由新华医院消化内镜诊治部9上海市小儿消化与营养重点实验室与上海大学材料工程学院合作合成。人胰腺癌SW1990细胞株购自中国科学院。4,6二脒基2—苯吲哚盐酸(4,6diamidin°2phenyl indole,DAPI)、3,4甲基2-噻唑基2,5二苯基溴化四氮唑、DMSO、活性氧检测试剂盒购自上海碧云天生物技术研究所。膜联蛋白Ⅴ-异硫氰酸荧光素/碘化丙锭购自美国Invitrogen公司。RPMI1640、0.25%胰蛋白酶、FBS购自美国Gib∞公司。RT-PCR试剂盒购自大连宝生物工程有限公司。

　　二、方法

　　1,量子点RGD整合素靶向探针对胰腺癌细胞靶向性的研究:将胰腺癌细胞接种于共聚焦观察培养皿,两个培养皿中分别加入量子点RGD整合素靶向探针5nm。l和量子点RGD整合素靶向探针5nmol+RGD1umol,37c孵育1h,PBS洗涤3次。4%多聚甲醛室温固定15min;采用DAPI进行细胞核定位标记,室温避光孵育15min。在激光共聚焦显微镜下检测成像。

　　2.分组:不加量子点、无光辐照培养的细胞为空白对照组。另设单纯光辐照组、光敏剂组、PDT组。光敏剂组和PDT组细胞中加终浓度为10nm°l/L的量子点RGD整合素靶向探针。单纯光辐照组和PDT组用波长为690nm(红光)、光照强度为20J/cm2的光辐照20min。3.MTT法检测细胞增殖情况:细胞接种于96孔板,每组设10个复孔。分别于处理24、48、72h时观察各组细胞的生长情况。490nm波长处测吸光度(A)值。细胞相对抑制率=(1一实验组A值/对照组A值)×100%。

　　4.荧光显微镜观察细胞形态学:因观察发现24h时细胞贴壁不久,处理时间过短,而72h时又因时间过久可能存在其他干扰因素,故将观察时间点定为48h,以下实验亦然。各组分别作用48h,细胞固定后用DAPI染色,荧光显微镜下观察细胞的形态变化。5,流式细胞术(flow cytometry,FCM)检测细胞凋亡率和周期变化:细胞接种于6孔板,每组5个复孔。48h后,用FCM检测各组细胞凋亡情况和细胞周期变化。6.活性氧检测:细胞接种于6孔板,处理48h后,运用2,7二氧荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA)探针检测活性氧表达,具体方法参照文献E6]。

　　7,RT PCR法检测基因表达:基因引物序列由上海生工生物工程有限公司合成。髓样细胞白血病1(Mc'1)引物上游5′-AAAGCCTGTCTGC CAAAT3′,下游5′TATAAACCCACCACTCC-G3′,产物为196bp。蛋白激酶B(A乃莎)引物:上游5′AAGCACCGCGTGACCATGAA3′,下游5′TCTTAATGTGCCCGTCCTTG3′,产物为445bp。肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tum。r necrosis fact°r rclated apoptosis inducing ligand,TRAⅠL)引物:上游5′-TGGCTAACTGA—CCTGGAA3′,下游5′—GGAAACCTGGAGG-CTACT3′,产物为415bp。内参照GAPDH引物:上游5′CATGGTCTACACGTTCCAGT3′,下游5′GGCTAAGCAGTTGGTGGTGC3′,产物为349bp。PCR反应条件:94℃3min,94C 30s,55·C30s,72C1min,35个循环,72C 5min。G⒋PDH作为内参照。用凝胶成像分析系统进行灰度扫描,目的基因mRNA相对表达量=标本目的基因平均灰度值/同一标本GAPDFf平均灰度值。

　　三、统计学方法用SPSS17.0软件进行统计分析,计量资料用均数±标准差(勇土s)表示,正态分布数据采用单因素方差分析和Sttldent-Neuman-Keuls检验,非正态分布数据用非参数检验。P(0.05为差异有统计学意义。

　　结果

　　一、量子点RGD探针对胰腺癌细胞的靶向标记量子点在543nm波长处被激发出红色荧光且量子点RGD探针对胰腺癌细胞呈现靶向标记作用,主要标记在胰腺癌细胞的细胞膜及细胞质中。加人过量的RGD阻滞该探针后,该探针的靶向标记作用消失。见图1、2。

　　二、MTT检测细胞增殖同一时间点PDT组的细胞抑制率均高于其余三组,差异有统计学意义(24、48、72h时的F=73.00、85.10、126.58,P均<0.01),而单纯光辐照组、光敏剂组与空白对照组相比,细胞抑制率差异均无统计学意义(P均>0,05)。见表1。

　　三、DAPI荧光染色经处理48h后,荧光显微镜下可见PDT组细胞核呈波纹状,部分细胞核染色加深,呈高亮蓝色,边界模糊,核明显固缩,随着时间的延长,大量细胞核浓染、固缩、碎裂。其余各组细胞均未见有明显的改变。

　　四、FCM测定细胞凋亡率、周期空白对照组、单纯光辐照组、光敏剂组和光动力学疗法组胰腺癌SW1990细胞处理48h后,PDT组细胞凋亡率(17.860%±1.230%)高于空白对照组(7.620%±1,219%)、单纯光照组(8,380%±0.277%)及光敏剂组(8,960%±0,673%),差异有统计学意义(F=130.617,P<0,01)。与空白对照组相比,PDT组G0/G1、S期出现阻滞(r=6.028、8.144,P均(0,05),见表 2。

　　五、各组细胞活性氧表达检测PDT组每个高倍镜视野下荧光表达的细胞数(286.000±5,5o8)高于空白对照组(28.000±2,64ω、单纯光照组(34,000±2。o82)及光敏剂组(36,000±4.163),差异有统计学意义(F=3262.559,P<0,o1)。见图4。

　　六、RT-PCR检测相关基因表达空白对照组、单纯光辐照组、光敏剂组和PDT组A乃r mRNA相对表达量分别为1,3319±0.0482、1,3137|0.0100、1.2900二Lo,o116、o.6161|0,0032,PDT组表达低于其余三组,差异有统计学意义(F=567,456,P(0.05);McJ1mRNA相对表达量分别为0,9864±o.oo56、1,0467±0.0248、1.0187±0,0205、0.3394±o.o451,PDT组表达低于其余三组,差异有统计学意义(F=狃6.817,P(0.o5);TRAⅠL mRNA相对表达量分别为0,6221±0.0076、0,6o75=L0.oo72、0,6189|o.0114、0,7239|0,0017,PDT组表达高于其余三组,差异有统计学意义(F=145.238,P(o.05),见图5

　　讨论

　　PDT中光敏剂选择性聚积于肿瘤组织内,并在特定波长光照下,通过光化学或光生物学反应对肿瘤组织产生杀伤效应。PDT治疗的局限性在于组织器官对光敏剂的分布和摄取不具特异性,提高PDT治疗的靶向性显得尤为重要。量子点是由Ⅱ至Ⅵ族或Ⅲ至Ⅴ族元素组成的纳米颗粒,在激发光诱导下能发射荧光E叫。量子点可直接作为光敏剂或用于能量转移以提高传统光敏剂的光动力疗效E:。将肿瘤细胞表面抗原的抗体或肿瘤新生血管表达分子的配体与量子点耦联,产物作为光敏剂,即能显著增强PDT肿瘤治疗的靶向′l±及安全性,减少对周围正常组织的损伤。

　　前期实验表明胰腺癌SW1990细胞表达整合素αvβ3[5]。含有RGD序列的小分子多肽是整合素αvβ3受体拮抗剂,对肿瘤细胞和(或)月中瘤新生血管内皮细胞具有高选择性与高亲和力。量子点一RGD探针可作为高选择性的胰腺癌细胞靶向光敏剂。

　　通过激光共聚焦显微镜观察量子点RGD整合素靶向探针对胰腺癌细胞的荧光成像情况。结果显示量子点RGD探针对胰腺癌细胞呈现靶向标记,主要标记在胰腺癌细胞的细胞膜及细胞质中。加人过量RGD后,该探针的靶向标记作用消失,提示RGD与胰腺癌细胞膜上的整合素受体特异性结合,竞争性抑制了量子点RGD探针的作用,从而使荧光标记消失。

　　MTT结果示,从24h开始,PDT组细胞生长速度慢于对照组,随着PDT处理时间的延长,细胞抑制效果更加明显。而单用量子点或光辐照处理,均不对细胞造成显著杀伤。FCM结果示PDT组细胞凋亡比例显著高于其他各组,细胞的G0/G1期和S期阻滞也非常明显。提示以量子点-RGD整合素靶向探针为光敏剂的PDT确实能够抑制胰腺癌细胞增殖,促进细胞凋亡。与李践[1]和Yu等E9]其他学者对胰腺癌体外PDT治疗的研究结果类似。Xie等[l叫发现裸鼠胰腺癌移植瘤中,PDT联合化学治疗药物吉西他滨能有效抑制胰腺肿瘤的增殖,杀伤肿瘤细胞,也证实了PDT对胰腺癌细胞的抑制和杀伤作用。

　　本实验中PDT组Akt、Mc1-l表达减少,而TRAIL表达增多,均促进细胞凋亡。活性氧是线粒体损伤和凋亡的激活剂,癌细胞对氧自由基十分敏感。本实验结果表明,PDT后胰腺癌细胞活性氧产生增加。推测PDT促进胰腺癌细胞产生大量活性氧,这可能是进一步诱发凋亡的启动因子。此结果与Luo等[11]报道类似。另有文献报道,量子点被肿瘤细胞吞噬后,最终定位于溶酶体E1剑。溶酶体是PDT的主要靶细胞器。溶酶体破裂后释放组织蛋白酶,继而激活mspase家族或抑制Bc⒈2家族,参与线粒体通路的细胞凋亡。与本实验中Bc⒈2家族凋亡相关基因Mcl-11和TRAIL的变化一致。

　　综上所述,以量子点RGD整合素靶向探针为光敏剂的靶向PDT能抑制胰腺癌细胞增殖,促进其凋亡。其机制可能与胰腺癌细胞活性氧产生增加,氧化应激水平增强,细胞线粒体损伤,从而启动线粒体途径的细胞凋亡有关。参考文献

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