基质金属蛋白酶17在胃癌中的表达及临床意义

　　胃癌是常见的消化系统恶性肿瘤,侵袭和转移是其最主要的生物学特征[1]。研究表明,基质金属蛋白酶(matrix me忱lloprot0nasc,MMP)与胃癌的侵袭和转移密切相关。本研究检测胃癌组织中MMP17蛋白和mRNA的表达,并与萎缩性胃炎组织、正常胃黏膜组织对照,分析其与胃癌临床病理特征间的关系。

　　对象与方法

　　一、病例来源及临床资料

　　收集武汉大学人民医院2010年2至5月外科胃癌手术患者42例,其中男25例,女17例;年龄为38~72岁,中位年龄为54岁;病变长度≤2cm者⒛例,>2cm者22例,所有胃癌患者术前均未行放射和化学治疗,留取胃癌组织手术标本。另留取40例萎缩性胃炎患者和42例胃镜检查结果正常者的胃黏膜组织标本为对照。所有标本均分为2份,一份立即固定于4%多聚甲醛溶液中,石蜡包埋,用于免疫组织化学检测;另一份保存于液氮中供RT PCR检测。依据1992年美国联合癌症分类委员会、日本胃癌研究会和国际抗癌联盟制订的胃癌TNM分期标准,胃癌患者中T1期18例,T2至T4期24例;无淋巴结转移22例,有淋巴结转移20例。组织学分级为I级者13例,Ⅱ和Ⅲ级者29例。肿瘤位于胃窦者16例,胃体者19例,贲门者7例;浆膜受累19例,未受累23例;生存期(2年者10例,生存期≥2年者32例。

　　二、免疫组织化学链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶(streptavidin-perosidase,S-P)法测定MMP17蛋白的表达

　　1.主要试剂:MMP17兔抗人单克隆抗体购自美国Abcam公司,βacon鼠抗人单克隆抗体和免疫组织化学染色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术公司。

　　2.主要步骤:将4um石蜡切片脱蜡至水,以3%H202处理10min阻断内源性过氧化物酶,微波修复10min,以1O%山羊血清室温封闭⒛min,加MMP17单克隆抗体(1:100),4C湿盒中过夜,滴加二抗、三抗,室温湿盒内孵育⒛min,二氨基联苯胺显色,苏木精复染,常规脱水,封固。由两名病理科医师采用双盲法进行染色结果判定。在高倍显微镜(×400)下进行细胞计数,每张切片选择5个视野,每个标本计数3张切片。阳性细胞百分率精确到个位数,分为4个等级:≤5%计0分,6%~⒛%计1分,26%~5o%计2分,)50%计3分。染色强度评分标准:无染色计0分,弱染色(浅黄色)计1分,中等染色(棕黄色)计2分,强染色(黄褐色)计3分。根据两项评分之和判定MMP17蛋白的表达情况:0分为阴性(—),1~2分为弱阳性(+),3~4分为中等阳性(++),5~6分为强阳性(+++)。以PBS替代一抗作为阴性对照。

　　三、反转录PCR法测定MMP17的mRNA表达

　　总RNA提取按美国Inx/ltrogen公司TRIzol试剂说明书进行,紫外分光光度计测定RNA含量及纯度,应用PⅡmer5,o软件设计MMP17和阡a山n引物的序列并由武汉巴菲尔生物有限公司合成。MMP17上游引物5′-GGTGCGTGCACTCATGTACT3′,T游引物5′-TCATCGTCAAAGT-GGGTGTC3′,产物长度为216bp;阡actin上游引物5′CACGATGGAGGGGCCGGACTCATo3′,下游引物5′TAAAGACCTCTATGCCAACACA-GT3′,产物长度为240bp。参照反转录试剂盒(购自加拿大Fermentas公司)说明书合成cDNA,反应体系如下:总RNA1ug,T重复寡核苷酸1,0ul,无RNA水解酶的双蒸水补齐至11ul9短时离心;65C5min,冰上1min,短时离心;按顺序加人5×缓冲液4ul,RNA水解酶抑制剂1ul,10mmol/L脱氧核糖核苷混合物2ul;莫洛尼鼠白血病病毒反转录酶1ul;混匀,短时离心,42C 60min,70C5min,反应结束后置于冰上。PCR扩增反应及半定量分析:反应体系为25ul,包括反转录所得cDNA1ul,上游和下游引物各1ul,2×Master混合物12,5ul,双蒸水补至25ul°扩增条件为94C4min;MMP17为94C30s、52C30s、72·C25s,30个循环;β-actin为94C 30s、56°C30s、72℃25s,30个循环;72C 4mh,4C4min。取10ml产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳,结合Syngene凝胶成像分析系统和Mulo Gauge V3.1软件进行吸光度(A)值分析。

　　四、统计学处理

　　采用SPSS17.0软件包进行统计分析,免疫组织化学染色结果的分析采用卡方检验,两组间反转录PCR结果的分析采用莎检验,3组间反转录PCR结果的分析采用单因素方差分析。P<0.05为 差异有统计学意义 。

　　一、MMP17蛋白和mRNA在胃癌组织、萎缩性胃炎组织及正常胃组织中的表达MMP17蛋白阳性表达细胞的胞质被染成浅黄色、棕黄色或黄褐色。在胃癌组织中,MMP17阳性细胞呈散在片状或巢状分布,癌巢边缘表达较强,见图1,除癌细胞阳性染色外,还可见靠近癌细胞的间质细胞有表达,见图2,提示间质细胞在肿瘤进展中起着支持和活化作用,这在肿瘤侵袭和转移过程中发挥重要作用。萎缩性胃炎组织和正常胃黏膜组织中的表达见图3、4。MMP17蛋白在正常胃黏膜组织与萎缩性胃炎组织中的阳性表达率差异无统计学意义E7,1%(3/42)比10.0%(4/40),X2=0.21,P)0,05];在胃癌组织中的阳性表达率[73,8%(31/42)]高于正常胃黏膜组织和萎缩性胃炎组织(X2=38,74和34.10,P均(0,05)。MMP17mRNA在正常胃黏膜组织与萎缩性胃炎组织中的表达水平差异无统计学意义(0,226±0.032比0,254±0,074,矽=0,602,P>0.05);在胃癌组织中的表达水平(0.476±0.043)高于正常胃黏膜组织和萎缩性胃炎组织(莎=8.079和4,493,P均(0,05),见图5。

　　二、MMP17蛋白和mRNA的表达与胃癌临床病理特征之间的关系MMP17蛋白和mRNA的表达与胃癌浸润深度、淋巴结转移情况及浆膜受累情况有关,与年龄、性别、病变长度、组织学分级、病变部位均无关,见表1。

　　三、MMP17蛋白和mRNA的表达与生存期之间的关系生存期<2年者的MMP17蛋白阳性表达率和mRNA表达水平显著高于生存期≥2年者(X2=12.71,莎=4,2砼2,P均(0,05),见表1。

　　讨论

　　胃癌是对人类健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一,进展期胃癌的5年生存率仍然很低,因此揭示胃癌侵袭、转移的机制,寻找判断其转移潜能的标志物,是当前临床研究的重要课题。

　　目前研究表明,MMP参与了胃癌发展过程中的多个步骤,在胃癌侵袭转移中发挥重要作用。

　　本研究采用免疫组织化学S-P法和RT-PCR方法检测MMP17在42份胃癌组织、42份正常胃黏膜组织及奎0份萎缩性胃炎组织中的表达,结果显示:正常胃黏膜组织和萎缩性胃炎组织中MMP17蛋白表达率和MMP17mRNA表达水平均明显低于胃癌组织,提示MMP17与其他MMP一样在胃癌中存在高表达[ls明,但其在胃癌早期发展过程中并不起主导作用,不能作为发现胃癌癌前病变的指标。

　　MMP17蛋白和mRNA的表达与胃癌浸润深度、淋巴结转移情况及浆膜受累情况有关,但与年龄、性别、病变长度、组织学分级、病变部位均无关,提示恶性程度高的胃癌MMP17表达增强。且MMP17低表达的患者生存率高。因此可用来预测胃癌TNM分期的高低,判断患者预后。

　　总之,胃癌组织中MMP17蛋白和mRNA的表达均增高,检测MMP17对于判断胃癌患者的预后有一定的临床参考价值。本研究例数有限,且为单中心研究,MMP17的表达是否具有地域差异,有待进一步证实。另外,胃癌本身是一个多因素、多环节的疾病,MMP17具体参与了哪些环节,其机制如何,有待进一步探讨。

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