山豆根致大鼠肝损伤外周血microRNA早期变化特征研究

微小RNA ( microRNA, miRNA)是一类内源性表达的、约有18一24个核昔酸的、非蛋白编码的小 RNA分子，这些小RNA分子主要通过转录后水平对靶mRNA起着负性调节作用[1]. miRNA在医学领域中的应用日益受到研究者的重视，越来越多的研究报道显示miRNA在化学性和酒精性肝损伤、肝炎病毒感染[3]、肝癌[4]及其他癌症[5 -7]等疾病诊断中可作为诊断生物标志物。动物实验研究亦表明miRNA 在对乙酞氨基酚所致小鼠肝毒性模型中可作为比常规肝功能指标更为灵敏、更为早期的肝损伤生物标志物。山豆根为豆科植物越南槐( Sophorae Tonkinensis Radix et Rhizoma)干燥根及根茎，性味苦寒，有毒。现代文献屡见服用山豆根中毒的报道，其毒性多因过量服用引起，其不良反应主要包括胃肠道反应和神经毒性反应。笔者前期研究发现大鼠连续26天灌胃山豆根12 g/kg，可造成肝功能指标 ALT水平显著升高，肝细胞超微结构检查可见细胞核变形有肿胀趋势，核膜皱缩，毛细胆管扩张，滑面内质网略扩张[11]。本研究以山豆根致肝损伤模型大鼠为研究对象，结合常规肝毒性评价指标—临床生化和肝组织病理形态学检查，重点观察外周血miRNA表达谱变化，以期筛选肝毒性的早期miRNA生物标志物，为药物性肝损伤的早期评价提供实验依据。

材料与方法

1动物Wistar大鼠60只，SPF级，雌雄各半，体重100- 120 g，由上海西普尔一必凯实验动物有限公司提供，动物合格证号:SCXK(沪)2008一0016。动物均在上海中医药大学实验动物中心SPF级饲养室饲养，室内温度控制在20-25℃,湿度为40%一70%.工作照度12 h明/12 h暗。实验期间，动物自由饮水。

2药物制备山豆根，产地:广西，批号: 0903125，购于四川新荷花中药饮片有限公司，经上海中医药大学中药学院李西林副教授鉴定系为豆科植物越南槐(Sophora tonkinensis Gapnep.)的干燥根及根茎。药液制备:称取山豆根药材，加水浸泡1 h后，先煎煮0. 5 h，过滤，再加水煎煮0. 5 h，合并2次滤液，浓缩至0. 6 g生药/mL,4℃冷藏，备用。参照 2010年版《中国药典》山豆根含量测定方法对山豆根药材及其水煎液中苦参碱、氧化苦参碱含量进行测定，作为山豆根药材及其水煎液的质量控制。山豆根中苦参碱含量为0. 414%，氧化苦参碱含量为0. 580;山豆根水煎液中苦参碱含量为3.65 mg/mL，氧化苦参碱含量为0.03 mg/mL。

3主要试剂ALT试剂盒，R1，批号:L922，R2，批号:L917 ; AST试剂盒，R1，批号:B023,R2，批号:L917; 碱性磷酸酶(ALP)试剂盒，R1，批号:B018, R2，批号: J916，均由日本世诺临床诊断制品株式会社生产。总蛋白(TP)试剂盒，R1，批号:L091241;白蛋白(ALB)试剂盒，R1，批号:L100211，均由上海复星长征医学科学有限公司生产。下BIL试剂盒，R1，批号:ER731 , R2，批号: ER733，由日本和光纯药工业株式会社生产。下RI rea- gent BD，批号:TB-12购自美国MRCgene公司。miR- CURYLNAT"' microRNA Array(含有1 891条探针)，批号:208402 , miRC U RYT芯片标记试剂盒，批号: 208032-A，杂交试剂盒，批号:208021，均购自丹麦EX- iqon公司。FO-PCR试剂盒，购自上海达为科生物科技有限公司。DEPC处理水，购自上海赛百盛基因公司。

4主要仪器日立7080全自动生化分析仪(日本日立贸易有限公司);Olympus BH一2光学显微镜 (奥林巴斯光学株式会社);Agilent1100高效液相色谱仪;Nandrop ND-1000 instrument(美国Nano- drop公司制造);TY8824 Axon GenePix 4000B扫描仪(美国Axon公司);杂交仪(美国NimbIeGen公司);Real-time PCR检测仪(7500Sequence De- tection System，美国ABI) ;6/10S手持式超细匀浆机(上海弗鲁克流体机械制造有限公司)。

5分组与给药60只大鼠按随机区组分为对照组和山豆根组，每组30只。山豆根组给予山豆根水煎液12 g/kg(2 mL/100 g，相当于临床用量的120倍)灌胃，对照组灌胃等容量蒸馏水，连续给药3 ,7 ,14 ,28天。

6而液化指标检测及肝组织病理形态学检查 两组分别于给药乙7 ,14 ,28天和停药后28天各处理 6只大鼠。以25%乌拉坦溶液1 g/kg麻醉动物，取 2 mL全血采用EDTA抗凝，用于miRNA芯片检测; 剩余全血5 000 r/min ,4℃离心15 min，取血清，采用全自动生化仪测定ALT, AST/TBI/ALP、TP和 ALB水平，计算球蛋白(GLO)水平。HE染色对肝组织进行病理形态学检查。

7芯片检测采用Trizol法抽提总RNA，经质量检测合格后采用 miRCURYTM芯片标记试剂盒对抽提的总RNA样本进行标记，标记后的样本与miR- CURY LNA下M microRNA Array芯片进行杂交， miRNA芯片探针信号采用Axon GenePix 4000B芯片扫描仪进行扫描，GenePix pro V6.0软件读取原始信号值(Foreground)，处理数据。

8差异表达miRNA的筛选GenePix pro V6. 0软件读取原始信号值，经背景值的校正、中位数标准化处理后，采用差异倍数(fold change，FC)计算方法，以FC>1.30或FC >0.77为标准进行差异表达miRNA的筛选。

9 miRNA靶基因预测差异表达miRNA靶基因采用targetscan V5.1数据库(http : //www. tar- getscan.org/)进行预测。

10靶基因pathway分析经预测的靶基因采用DAVID数据库(http://david.abcc.ncifcrf.gov/)进行pathway分析。通过显著性P值、误判率和靶向性富集度3个方面综合评价pathway的重要程度 pathway的筛选标准为P < 0. 05. DAVID数据库对 pathway的分析引用京都基因与基因组百科全书 (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes， KEGG)数据库对靶基因进行相关代谢学途径分析

11给药7,14、28天共有差异表达miRNA时效关系各时间点差异表达miRNA随给药时间延长均可绘制时效曲线，根据FC值，筛选7 ,1东28天共有差异表达miRNA时效高峰在药物干预早期(7天)的m i RNA。

12差异表达miRNA的RT一PCR验证对于芯片筛选具有早期性差异表达的miRNA进行RT一PCR 验证，同时进行肝组织中差异表达miRNA的验证。

13统计学方法应用SPSS 16. 0统计软件，计量资料以X士S表示，相同时间点两组间比较采用T 检验，P < 0. 05为差异有统计学意义。

结果

1两组大鼠血液生化指标及肝组织病理形态学比较(表1，图们与对照组同期比较，山豆根组于给药 7 ,14 ,28天ALT明显升高(P < 0. 05 )，停药28天恢复正常;ALP于给药14天明显升高(P<0.05)，停药28 天恢复正常;AST、TBIL、TP,ALB,GLO变化不明显。光镜下观察，山豆根组于给药28天1只大鼠肝组织出现肝细胞变性肿大，停药28天恢复;两组给药3,7,14 天及停药28天大鼠组织病理形态学均无明显变化。

2总RNA的质量控制紫外检测下，各时间点对照组和山豆根组样本A260/A280均在1.8一2.1之间，凝胶电泳中，总RNA28 s和18 s两条带清晰， 28 s/18 s均大于1.5，总RNA质量合格，完整性好，无降解及污染现象.

3差异表达miRNA的筛选结果(表2一4，图 2)山豆根组给药7,14,28天3个时间点的差异表达miRNA见表2一4。给药7,14 ,28天差异表达上调的miRNA分别为11个、22个、13个，差异表达下调 miRNA分别为1个、13个、2个.

4 miRNA靶基因预测结果(表5)本实验对以下3部分miRNA进行了靶基因预测:(1 )7天时差异表达miRNA; (2)7天差异表达miRNA在14天时仍表现为差异表达的miRNA; (3)在28天时仍表现为差异表达的miRNA。各时间点差异表达miRNA个数以及各时间点能检索到的差异表达miRNA个数见表

5. 7,14,28天的5个共有差异表达miRNA为 m i R-142 -5 p、m iR-207、miR-291 a-5p、m iR-300-5p、 miR一494基因pathway分析结果.

5.1 7天差异表达miRNA调控的pathway 山豆根12 g/kg连续给药7天，主要影响细胞的信号转导通路(Wnt,TGF-日、ErbB , MAPK, mTOR和In- sulin信号转导通路)、细胞间相互作用(Focal adhe- sion,Adherens junction)、细胞骨架(Regulation of actin cytoskeleton)、免疫相关(Endocytosis , Leu- kocyte transendothelial migration)和蛋白质的水解(Ubiquitin mediated proteolysis )，另外，还有部分与神经和癌症相关的通路。 5.2 7天差异表达miRNA在，4天所调控的 pathway 7天差异表达miRNA在14天仍表现为差异表达者有4个，其主要影响细胞的信号转导通路 ( Wnt, ErbB和下GF-日信号转导通路)、细胞骨架 (Regulation of actin cytoskeleton)、细胞间相互作用(Focal adhesion ,Adherens junction )、免疫相关 ( Endocytosis )、蛋白质的水解(Ubiquitin mediated proteolysis )，另外还有部分与神经相关的通路。

5.3 7天差异表达miRNA在28天所调控的 pathway 7天差异表达miRNA在28天仍表现为差异表达的有3个，其主要影响细胞的信号转导通路 ( Wnt,TGF-p信号转导通路)、蛋白质的水解(Ubiq- uitin mediated proteolysis )、细胞骨架(Regulation of actin cytoskeleton)、细胞间相互作用(Focal ad- hesion)、免疫相关(Endocytosis)。

5.4 7,14,28天共有差异表达miRNA时效关系以7,14,28天3个时间点共有的5个表达上调 miRNA作FC对时间的变化曲线(FC一下曲线)，筛选到时效高峰在7天的3个上调的差异表达miRNA，其差异表达FC见表6。经targetscan数据库检索到 miR-291 a-5p和miR-300-5p, pathway分析结果: miR-291 a-5p调控的靶基因在落人的pathway，主要与信号通路(ErbB , Wnt, T cell receptor signaling pathway、细胞间相互作用(Focal adhesion)和细胞骨架(Regulation of actin cytoskeleton)相关; miR-300-5p调控的靶基因在落人的pathway共有2 条，主要与神经系统相关。

6外周血miRNA在芯片和肝组织中表达的 RT-PCR验证结果(表7)山豆根致肝损伤外周血 miR-291 a-5p的芯片验证结果显示:与对照组同期比较，山豆根组给药7天m iR-291 a-5p表达显著升高 (P < 0. 01)，给药28天表达显著降低(P < 0. 01)。肝组织验证结果显示:与对照组同期比较，山豆根组给药 7,14天miR-291 a-5p表达显著升高(P < 0. 01)，28 天表达亦有升高趋势(P> 0. 05 )。

讨论

miRNA主要通过与其靶m RNA的3’非翻译区 (3'-untrans-atedregion,3'-UTR)互补性结合，在转录后水平发挥RNA介导的基因沉默( RNA-mediat- edgene sileneing)，miRNA“种子序列’，(含有7 个核昔酸，第2一8个核昔酸)与其靶m RNA的3'- UTR互补性结合程度及稳定性决定了m RNA的受抑制程度。m iRNAs参与细胞增殖和定向分化、发育、凋亡、免疫应答、心血管发育和重建以及脂类代谢等基本生命活动的实时广泛精细调控，[13-16]，并与种人类疾病的发生发展密切相关[17]. 在正常状态下外周血miRNA的种类及其表达丰度可能处于一个相对平衡的状态，而当机休内受到外界刺激而发生组织、器官的代谢异常或器质性病变会促使受损细胞组织内源性miRNA释放到外周，表现为特定疾病状态下某些外周血miRNA的表达水平发生显著性变化。因此本实验对山豆根所致肝损伤大鼠外周血miRNA的变化进行了研究，并结合常规临床生化和肝组织病理学检查，分析肝损伤早期外周血 miRNA的变化，以期寻找肝损伤早期的miRNA标志物。

结果显示，山豆根给药7 - 28天血清ALT明显升高(P < 0. 05 )，给药28天大鼠出现肝细胞肿大，提示山豆根12 g/kg连续给药28天可引起肝功能性指标和肝组织形态学变化。本实验对肝损伤早期差异表达 的miRNA在14天和28天的变化进行了分析。 对各时间点差异表达miRNA的靶基因预测和 pathway分析显示，在肝损伤的进程中，Wnt , TGF-(3 信号转导通路、细胞间相互作用、细胞骨架、免疫相关的细胞内吞受到差异表达的miRNA的调控，可能参与了肝损伤的进程，提示这些pathway与肝损伤关系密切。 差异表达miRNA随给药时间的变化，呈现一定的时效关系。时效高峰在7天的miRNA参与了损伤的发生、发展，并且在早期就能体现。对时效高峰在7 天的差异表达miRNA进行验证，考察其变化能否提示损伤的进程。 7 ,14 ,28天共有的5个差异表达miRNA，发现有3个上调miRNA的差异表达高峰在7天，即在早期就能表现出差异表达，通过targetscan数据库对 miRNA的靶基因进行预测，并采用DAVID数据库对 miRNA调控的靶基因进行pathway的分析发现， miR-300-5p主要与神经细胞的分化有关，miR-291 a- 5p与Wnt信号转导通路、T细胞受体(T Cell recep- for，TCR)信号通路、细胞骨架以及细胞间相互作用等相关。 miR-291 a-5p能调控Wnt币-catenin信号通路， Wnt/(3-catenin信号通路与肝脏密切关系，肝细胞生长、再生，肝脏谷氨酞胺的代谢，自由基引起的氧化应激及肝癌的形成均与汗catenin有关[18 -21]。另外， miR-291 a-5p亦可调控TC R信号通路，TC R是由膜蛋白组成的复合物，参与激活丁细胞和抗原呈递过程。TCR的激活可以引起胞内信号级联反应，调节细胞增殖、分化和凋亡。

TCR与抗原的结合能引起下游蛋白的酪氨酸磷酸化，进而引起细胞外信号调节激酶(ERK) ,c-Jun N一端激酶(JNK)、N F-KB等通路的活化[23 -25 ]。而肝细胞的凋亡与ERK,JNK等 MAPK通路密切相关，肝细胞的炎症反应同N F-KB 亦密切相关。 miR-291 a-5p在芯片验证和肝组织验证中结果基本一致，外周血中miRNA的变化可提示肝组织中 miRNA的变化，肝损伤的过程中m i R-291 a-5 p所调控的pathway可能参与损伤的进程。由此推测，通过检测外周血中miR-291 a-5p的表达可提示肝脏的损伤。miR-291 a-5p可能作为山豆根致肝损伤早期的损伤标志物之一。miRNA芯片技术可用于发现药物致肝损伤的早期生物标志物，为中药肝毒性的早期生物标志物的研究及肝毒性的早期监测提供了新的思路与方法。

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