miR-15家族在肝脏疾病中的作用

微小RNA(microRNA, miRNA)为一类短小的内源性单链非编码RN A片段，长度约为22个核昔酸，可与靶mRNA的3' 非翻译区(3'untranslated region, 3'UTR)结合，通过miRNA诱导的沉默复合物(miRNA一induced silence complex, miRISC)降解或抑制靶mRNA的翻译从而负性调节靶基因表达水平。人类基因组存在1000余种miRNA，每种miRNA可能存在上百种靶mRNA, miRNA可能调节人类至少1/3的基因一‘-3，单个基因可由多个miRNA共同调控，因此miRN A的作用机制是非常复杂的。

在脊椎动物中，一些miRNA 5’端序列有相似性，特别是第 2位至7位(或第8位)核昔酸，为miRNA与靶mRNA碱基配对序列，称为种子区(seed region，对miRNA功能起决定性作用，并且这些miRN A的靶序列相同或相似。这类序列高度相似、拥有特征性种子区并存在共同靶基因的miRNA被归为一个超家族〔a。miR一15家族位于人染色体13q14，包括miR -15a,miR一15b,miR一16,miR一195 , miR一424 } miR一497等。在miR一15家族中发现miR一15x/16一1和miR一15b/16一2 为两个基因簇，其中miR一16一1与二R一16一2序列完全一致，miR一15a与miR一15b有4个核普酸不同，但种子区序列完全一致。研究证实miR一15x/16一1和miR一15b/16一2在大鼠、小鼠、恒河猴、人类等哺乳动物中序列完全一致，即存在高度保守h}5一。

miR一15家族参与调节人体多种重要功能活动，如细胞分化和周期调控、细胞凋亡、机体代谢、应激反应、血管生成等，在人类心血管疾病、白血病、淋巴瘤、乳腺癌、前列腺癌等疾病形成过程中发挥重要作用。最近已经有明确的证据表明，miR - 巧家族参与肝脏疾病的多种病理生理过程，与炎症反应、凋亡、坏死、再生、纤维化和癌变等均有密切关系，有可能成为某些肝脏疾病的血清学标记物和治疗靶点，下面分别进行阐述。

1 miR一15家族与肝癌

1. 1而R一16在肝癌诊断中的意义肝细胞癌( HCC)是我国常见的恶性肿瘤之一，但由于目前肝癌早期诊断手段十分有限，只有不到1/3的患者能够早期诊断(肿瘤直径<3 cm)，临床应用最广泛的肝癌指标甲胎蛋白(aFP)的敏感性仅有39% 一65 %，特异性为76%一94 %，诊断早期肝癌的敏感性和特异性更低「7。Qu等H」通过分析105例病理学确诊的HCC患者、107例慢性肝炎患者及71例正常人的血清，发现HCC患者 miR一16水平较慢性肝炎患者下降约2倍(P<0.01)，较正常人群下降达8倍(P<0.01)。进一步分析表明，在AFP,AFP 异质体(AFP一L3)、去y一浚基凝血酶原(de、一y一carboxypro- thrombin , DCP)检测阴性的26例HCC患者中有18例miR一16 检测阳性(占69. 2% ) ;26例患者中21例为早期HCC，其中16 例miR一16阳性(76. 2%;仅有12. 5%的慢性肝炎患者miR 一16阳性。单用AFP诊断HCC的敏感性为59 %，联合miR- 16则上升至87.6% ;AFP,AFP一L3和DCP联合应用敏感性为 75.2%，加人miR一16后上升至92.4% (P <0.01)，特别是早期HCC敏感性从51. 2%上升至88.4%(P<0.01)。以上提示 miR一16可作为新的肝癌标志物进一步研究

1.2 miR一lsb在肝癌诊断中的意义miR一巧家族的另一成员miR一lsb在肝癌诊断方面也具有一定的意义。Cbunn 等9一通过miRN A微阵列技术对比2s例HCC患者的肝癌组织和癌旁组织，发现449个miRN-4中共有21个miRN:1在肝癌组织中发生显著性变化(P<0.05)，包括miR一15家族}} miR 一15b(P=0.000 292)表达显著上调，miR一19s(P二0. 00 324)及 miR -497(尸=0. 004 619)表达下调一项回顾性队列研究中，Liu等’。应用qRT一PCR法检测96例HCC根治术患者肝癌组织及对应的癌旁组织的miRNA表达，发现共105个miR- NA发生改变(P<0.01)，其中6种miRN' A ( miR一15b、一21, 一130b、一183、一224、一30U在AFP < 400 n舒ml的肝癌组织中明显上调。比较s7例HCC患者、59例慢性肝病患者与正常人血清中4种miRNA ( miR一15b、一21、一130b、一183)的表达，发现miR一15b诊断HCC敏感性为98. 3%，特异性为 15.3 %，是4种miRNA中最高的。miR一15b联合miR一130b 诊断HCC敏感性无变化，特异性可升至91. 53%，在AFP < 20 n剔ml的30例HCC患者中敏感性为%.7%，特异性为 91. 5%此外，肝癌根治术的15例患者术后血清miR一15b较术前有所下降(64. 1拷贝/ng vs 177. 6拷贝/nananP二0. 0637 ) 体外研究1。也表明培养的6种肝癌细胞系(HepG2, Hep3 B , PLC/PRF/5 ,MHCC一97H,SNU475,SNU76功上清液中miR - 巧b水平均较正常肝细胞系显著升一高达2一6倍(P均 <0.01)，提示miR一15b可能来源于肝癌细胞。因此作为新的肝癌标志物，miR一15b具有很大的诊断和鉴别诊断价值。

1.3 miR一15 a/15 b与肝癌切除术后复发HCC根治性手术治疗是目前肝癌的首选治疗方法，Chung等I}9J应用K Nearest N ei一ghbOr算法预测肝癌组织的7个miRNA与HCC根治性切除术后肝癌复发具有相关性(精确度90 %)，其中miR一15b与 HCC复发呈明显负相关。进一步研究表明，SNU475细胞过表达miR一15b能够抑制细胞增殖，并诱导细胞凋亡;相反，沉默 miR一15b能够促进细胞增殖并抑制肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TNF related apoptosis inducing ligand, TRAII)诱导的细胞凋亡，提示过表达miR一15b抑制肝癌细胞增殖并诱导凋

亡的作用是HCC根治性切除术后复发率降低的主要原因。另一项研究发现匕i}，肝癌根治性切除术后患者癌旁组织miR - 15a和miR一15b的高表达可预示长期不复发(P二0. 027 , P 0. 043 )。由此，miR一15a}miR一15b均被评价为肝癌切除术后复发的重要指标。

1.4 miR一15/16与肝癌的发生miR一15家族是潜在的抑癌基因，那么miR一巧家族是如何调控肝癌的相关基因呢? Skawran等’z发现在低分化肝癌和肝癌缺失13q时均能使6 种基因(BIC,CPVEl,RBPMS,RFC4,RPSA,TOP2A)表达上调2 一4倍，这6种基因参与调节细胞周期和细胞增殖。而miR - 621,miR16一1 } miR一15a恰好位于13q，因此推}}} miR一15 a/ 16一1的缺失可能调节细胞周期相关基因的表达并参与了肝癌细胞去分化，但具体机制尚不明确。 如前所述，miR一15家族能够抑制肝癌细胞的增殖并诱导肝癌细胞凋亡多项研究发现，miR-16的靶基因为抗凋亡基因BC1一2-}}-" _ miR一151)的靶基因为抗凋亡基因BCL - 从’过表达miR一16和miR一15b均能促进肝癌细胞的凋仁.抑制他们则起到相反的作用。以上研究结果也为miR - 15b可能会减少HCC根治性切除术后复发率提供了依据。 多项研究表明MCLl , CCIVDI和WNT3A等基因也是mR 一75x/16的靶基因。这些基因均参与调节肿瘤细胞的增殖和凋亡’5_1h_ }'。等’9发现转染HBx质粒至‘HepG2 , HuhZ和 SK一HEP一7肝癌细胞系，可以通过上调癌基因c一Myc使 miR一l}a,miR一15b和ri2iR一16的:表达下调2倍(P均< 0.01),CCNDl表达也同时在增加(P<0.001)。单独转染h1iR 一16抑制物能够促进HepG2细胞从G1到S期的转换进而促进其增殖;转染miR一16模拟物于HepG2一hbx细胞则能够显著抑制细胞增殖及集落形成，细胞周期停滞在G7期，细胞凋亡增加。由此推测，HBV可以通过调节miRNA导致肝癌的发生，即HBx-c'一Mvc卞-miR一15/16 ;.-CCND1个一细胞周期G1/S的转换介一肝癌细胞增殖个凋亡牛，从而揭示了HBV 相关肝癌新的发生机制。

1.5 miR一195与肝癌的发生miR}15家族中的另一个成员miR一195也与肝癌的发生有关。Xu等「’。〕的研究显示，与癌旁组织相比，高达85.7%的肝癌组织中miR一195表达显著下降，64. 3%下降达2倍以上。健田胞实验证实5种肝癌细胞系 miR一195表达均显著下降，上调miR一195可阻断细胞周期 Gl/S转换，抑制肝癌细胞体外形成克隆的能力，甚至抑制肝癌细胞在裸鼠中发展成为肿瘤;抑制miR一195则可促进细胞周期进展。作用机制包括;(1)miR一195直接作用于细胞周期调控相关靶基因CCND1 ,CDK6和E2F3;(2) miR一195抑制抑癌基因Rb的磷酸化及其下游靶基因F2 F3的激活一这些结果提示miR一15家族为重要的肿瘤抑制因子，miR一15家族通过靶向协同调节肝癌细胞周期相关基因的表达调控肝癌细胞周期，发挥抑制HCC的作用:

2 miR一15家族与急性肝衰竭 在急性肝衰竭( acute liver failure , ALF)进展过程中，TNFcx 介导的过度免疫级联反应是导致大量肝细胞凋亡和增殖受抑的重要途径，但是作用机制尚未完全明确〔z‘一。A。等zz通过基因芯片技术发现在D一Ga1N/LPS诱导的ALF小鼠肝脏中共有95个miRNA的表达显著改变，在上调的20个凋亡相关基因中变化最为显著的是miR一15b和miR一16 ; miR一15b在 Sh和7h分别上调2倍和1. 5倍(P<0.O1,P<0.05)gmiR- 16在Sh和7 h分别上调2. 5倍和1. 8倍(P<0.O1,P< 0. OS );同时BCL一2表达显著下降(P<0.01)应用D - GaIN/TNF。诱导人肝细胞系BNLCL2凋亡过程中，miR一15b 和miR -..16分别上调1.7倍(P < 0. 05)和2. 2倍(P < 0. 01) 沉默miR一15b和miR一16能使肝细胞凋亡率分别下降27 0/r 和24%(P<0.05),BCL-2蛋白表达上调约2倍(P<0.05) 由此可见，miR一15b/16能通过下调BC1一2表达诱导肝细胞凋亡，并参与ALF的发生。

3 miR一15家族与肝纤维化 肝纤维化是多种慢性肝损伤的基本病理过程是慢性肝病的共同病理学基础和发展至肝硬化的必经阶段，肝星状细胞 ( HSC)的激活与增殖是肝纤维化发生发展的中心环节23 Gu。等「z4」通过基因微阵列技术研究发现，与静止状态相比，原代培养激活的HSC有12个miRNA上调，9个下调。其中，niR 一15(P=0. 0003) ,miR一16(P=0.0034)均较静止状态下调 37 %。实验证实2s，活化的HSC miR一15b/16水平下降使 BCL一2和CCND1表达升高，转染miR一15b和miR一16降低 BCL -2,CCND1蛋白表达，细胞周期停滞于G1期;凋亡相关蛋白caspase3 ,8 ,9表达升高(P<0.01)，细胞凋亡率增加(P< 0. OS )。这一发现证实miR一15b和miR一16可以通过抑制 BCL一2和CCND1的表达而减少HSC激活，有望成为肝纤维变性的新型治疗方式。

4 miR一15家族与其他慢性肝病

4.1 miR一16与肝损伤Peng等26发现丙型肝炎患者肝组织miR一16较正常人上调2倍(P =9e一5)。Silvi。等[zz ;应用能稳定复制HCV生命周期的病毒一HCVcc感染人肝癌细胞系 Huh7. 5，细胞上清液中miR一16在感染后第10 d升高2. 1倍 (P<0.05),15 d时升高2. 9倍(P < 0. O5}。Silvia等}z,」检测了35例健康人和18例慢性丙型肝炎(CHC)患者血清，发现 CHC患者miR一16较正常人升高6. 3倍(P < 0. 0001 )，特别是在FO一F1期(Batts and Ludwig评分)高至6. 4倍(P < 0. 0001)，与肝纤维化程度无关。研究证实一z6- , miR一16通过负性调节丝裂原活化蛋白激酶( mitogen一activated protein ki- vase, MAPK14)来促进肝细胞凋亡，从而介导HCV引起的肝细胞损伤。此外，非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)患者血清中 miR一16也比健康人升高5. 5倍(P < 0. 0001 )，但与肝脂肪变的严重程度无关。提示miR一16的升高有可能作为评估CHC和非酒精性肝病损伤的新标志物。

4. 2 miR一巧家族与HBV为探讨肝脏内源性rniR1VrA对 HBV复制与基因表达的影响，张小勇等[?s通过miRN A靶点分析软件寻找与HBV序列之间相关联的肝脏内源性miRIVA，发现HBV mRN_4序列存在多个AL富集区(AU. rich elements , AREs)，可与miR一16完全互补，提示miR一16可能对HBV mRNA的稳定性存在影响。将体外合成miR一16寡核普酸与 1.3倍HBV全基因组真核表达质粒pU'C18一HBVI. 3共转染 HepG2细胞，发现miR一16能抑制HBsAg, HBeAg, HBcAg及 HBZ` DNA表达(P<0.01)，并且具有剂量依赖性，最高可分别降低48.7% ,62.7% ,50% ,28.7%，说明外源性miR一16可抑制HBV复制，肝脏内源性miR一16也可能具有相似的作用。另有研究报道3。一，HBV也能够反过来调节宿主细胞miR一15 家族的表达。HepG2. 2. 15为HBV基因稳定转染细胞株?9， Liu等「so采用miR1VA基因微阵列和Northern杂交技术分析 miRNA表达变化，发现HepG2. 2. 15细胞与它的前体HepG2 细胞相比，miR一lsa和miR一16均显著下调(p < o. os，其中 miR一lsa表达下调近3倍。c一myb和人成纤维细胞生长因子(FGF2)分别为。aiR一lsa和miR一16的作用靶点，HBV转染HepG2. 2. is细胞二者均显著上调。已知c一m沙和FGF2 与肝癌的发生有关，因此推测HBV感染可以通过影响宿主 miRN.1表达而导致肝癌的发生。HBV和miRN.4之间的相互作用对理解病原微生物与人体的关系提供了新的线索。

5结语

随着对miR一is家族的深人研究，miR一is家族应用于临床诊断和治疗的前景日益明确。miR一15/16有可能成为肝损伤和肝癌诊断的敏感指标，也有可能成为治疗肝衰竭、肝癌和乙型肝炎的潜在靶点或药物但是还需要开展更多的临床和基础研究.

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