FGFR4基因单核苷酸多态性和杂合性丢失在胃癌发病中的作用

研究[1]已证实,多种肿瘤存在成纤维细胞生长因子受体(FGFR)蛋白高表达,并且其第388密码子单核苷酸多态性(SNP)情况和杂合性丢失(LOH)与肿瘤的发生、发展及预后相关。本研究对胃癌患者的FGFR4第388密码子SNP情况和LOH发生频率进行研究,探讨其在胃癌发生发展中的作用,以及与肿瘤分期和患者预后的关系。

1材料与方法

1.1材料收集⒛07年7-12月上海交通大学医学院附属仁济医院普外科收治的50例原发性胃癌患者的胃癌标本及配对正常组织。50例胃癌患者屮,男性35例,女性15例;年龄37~87岁,中位年龄63岁;均接受了根治性胃癌切除术(D2),术前未接受新辅助化疗,术后行病理检查;随访年限至⒛09年7月.

胃癌侵及黏膜或黏膜下层1例,侵及肌层6例,穿透浆膜37例,侵犯临近组织或器官6例;胃周淋巴结受累34例(受累淋巴结数1~6个31例,7~15个3例),胃周淋巴结未受累16例;有远处转移3例,无远处转移47例。

按组织学分型:腺癌41例,未分化癌4例,黏液细胞癌2例,印戒细胞癌3例;按肿瘤分化程度:高分化癌(腺癌I~Ⅲ级)40例,低分化癌(低分化腺癌、黏液腺癌、印戒细胞癌、未分化癌)I0例;根据UICC胃癌TNM分期(1997年第5版):I期2例,Ⅱ期16例,Ⅲ期刀例,Ⅳ期5例。

1.2 DNA提取与测序手术中采集患者新鲜胃癌组织和正常胃组织(距肿瘤组织距离>125px),并保存在-80℃液氮中,肿瘤标本中的肿瘤组织)70%。应用纯化DNA提取试剂盒(Qiagen,美国)提取肿瘤组织及正常组织DNA,设计5对PCR引物(由上海生工生物技术有限服务公司合成)进行PCR扩增,覆盖ΓGFR4基因的外显子6、9、13、16、18,引物序列参照COSMIC数据库(表1)。使用BigDye Terminator kit3.1测序试剂和ABlGenehcAnalyzer3730xl基因测序仪,从正、反两个方向同时对PCR产物测序,荧光标记DNA片段。使用SeqScape25测序软件,将测序仪收集的光学信号转换成电泳图谱,并与美国国家生物技术信息中心(NCBI)的基因库数据比对,将所检测的突变与PubMed或基因数据库的结果进行比较.

测序软件在电泳图谱上标明了每个位点的碱基,通过碱基类型分析该位点是否存在SNP。电泳图谱⊥每个位点只出现一个波峰,代表该位点为纯合子;如出现两个波峰,该位点为杂合子,定义为信息个体。患有肿瘤的信息个体,只要DNA序列中的一个位点由正常组织的杂合子基因型变为肿瘤组织的纯合子基因型,即表明此肿瘤组织皋因在该标记位点发生了LOH。SNP标记发生LOH的肿瘤例数除以该标记的信息个体例数,记为该位点的LOH频率.

1.3统计学方法采用SPSS14.0软件进行统计学分析。计数资料采用n(%)表示,组间比较采用x2检验;理论频数<5时,采用Fisher’s精确检验。P<0.O5表示差异有统计学意义。

2结果

2.1 FGFR4基因体细胞突变情况

外显子9区域第401密码子发生1例体细胞突变(R401C,C>T);第403密码子发生3例体细胞突变(P403Pfs46),肿瘤组织的碱基序列发生移码突变,基因型由正常人的CGCC/CGCC变为CGCC/—ˉ。外显子16区域发生1例体细胞突变(R710Q,G>A)(表2,图1)。

2.2 FGFR4基因SNP情况

50例胃癌病例中均表达FGFR4基因,发现34例编码区非同义SNP(G388R,G>A),位点:码351855。检测出3例同时发生两类非编码区SNP:位点rs42409(T)C),位于内含子12区域内(外显子13前4l,ll);位点:$31776(G>A),位于内含子15区域内(外显子16前8bF,)(表3)。

2.3 FGFR4基因rs351855位点LOH情况

26例AG型杂合子胃癌患者中,rs35I855位点发生LOH频率为92.31%(24/26),其中23例为等位基因G丢失,1例为等位基因A丢失(图2)。

2.4 SNP与胃癌临床病理特征的关系

FGFR4第388密码子的三种基因型分别为GG型16例(32%),AG型%例(52%),AA型8例(16%),在三种基因型中胃癌pTNM分期比较差异无统计学意义(P>0.05);Arg388等位基因表达与否在pTNM分期中也无统计学意义(P>0.O5)(表4)。另外,hg388等位基因表达与否在肿瘤分化程度、肿瘤浸润深度及淋巴结转移的发生率方面,差异均无统计学意义(P>0.05)(表5)。

2.5LOH与胃癌临床病理特征的关系

26例AG杂合子基因型中,LOH发生频率为92.31%(24/26)。24例发生LOH的病例中,肿瘤细胞高分化者22例(91.67%),低分化者2例(8.33%);2例未发生LOH的病例中,肿瘤细胞高分化及低分化患者各1例。统计学分析显示,LOH发生频率在不同分化程度胃癌患者中差异无统计学意义(P>0.05);在不同肿瘤浸润深度、淋巴结转移及pTNM分期中的差异也无统计学意义(P>0.05)。

2,6SNP和LOH与患者预后的关系

GG型患者生存率为75.O0%(12/16),AG型患者生存率为92.31%(24/26),AA型患者生存率为87.50%(7/8),三组间生存率比较差异无统计学意义(P>0.05)。表达hg388等位基因的患者生存率为9118%(31/34),不表达Arg388等位基因的患者生存率为7500%(12/16),两组间生存率比较差异无统计学意义(P>0.O5)。发生LOH的24例患者中有1例(4.17%)死亡,未发生LOH的2例患者均存活,两组问生存率比较差异也无统计学意义(P>0.05).

3讨论

近10年来许多研究清晰地表明,基因组序列的变异——SNP参与了胃癌的发生和发展,FGFR属于受体酪氨酸激酶(RTK)家族的重要成员,FGFRs与其配体成纤维细胞生长因子(FGF)共同作用,调控一大类细胞发育的进程,包括细胞凋亡、增殖、移行和血管生成。目前已知的FGFR中,FGFR4在乳腺癌、胰腺癌及肾癌等恶性肿瘤中高表达。FGFR4基因位于染色体5q35.1,第388位密码子SNP位于该基因的外显子9区域,其hg388等位基因的表达与乳腺癌、前列腺癌等恶性肿瘤的发生发展、临床分期及患者预后密切相关.2000年,FGFR4首次被证实在人胃癌细胞中存在表达[2],2011年的实验进一步提示FGFR4通过调节细胞增殖和凋亡介导胃癌的发展[3]。然而,在胃癌患者的肿瘤组织或正常组织中,FGFR4第388密码子SNP情况及其与肿瘤的生物学特征、患者预后的关系,目前的研究报道较少。我们对50例胃癌的检测结果显示,A1.g388等位基因的表达在肿瘤不同分化程度中的差异无统计学意义;在肿瘤浸润深度、淋巴结转移情况及pTNM分期中的差异亦无统计学意义。近年来各项研究显示,FGFR4基因Arg388等位基因的表达与多种恶性肿瘤的分化程度、临床分期及患者预后的关系存在矛盾之处。

2002年Bange等[4]对82例结直肠癌患者的研究显示,Arg388等位基因的表达与淋巴结转移数和肿瘤pTNM分期有显著关联;而2005年跏ino1a等[5]检测了179名结直肠癌患者,Arg388等位基因的表达与癌症的发病率、生存率或预后指标均无显著联系。对上述差异目前尚无法明确解释,但有可能反映了FGFR4基因的SNP具有组织特异性,FGFR3基因中便存在这种现象。2010年对103例随访50个月的胃癌患者的研究[6]显示,hg388表达与否与胃癌pTNM分期无统计学关系,但预示着较差的预后。对于FGFR4Arg388在胃癌的肿瘤分化程度、临床分期及预后中的影响目前尚处于探索中,需进一步研究来证实。本研究发现,Arg388等位基因的表达不影响胃癌患者的生存率,不能直接提示较差的预后。FGFR4细g388与其他多种恶性肿瘤预后的关系,各项研究结果也存在矛盾。⒛07年Matakidou等[7]在对619例肺癌病例的研究中发现,hg388等位基因的表达也不提示较差的生存率。而在乳腺癌中,FGFR4hg388等位基囚是否影响患者的预后一直存在争论,多项研究结论不尽一致。究其原因可能是在乳腺癌中FGFR4Arg388等位基因的表达造成了三苯氧胺抵抗,降低了化疗敏感度,从而影响了患者的预后[8]。1983年,Cal/allee等[9]首先提出了LOH的概念,并认为高频率非随机的染色体LOH位点可能有抑癌基因(TsG)的失活,FGFR4基因位于5号染色体长臂(1ongarm。fchromosome5,5q)上的LOH已被证实发生于卵巢癌、胃癌、食道癌、睾丸胚细胞瘤等恶性肿瘤中。αeeson等[10]在胃癌患者5q染色体上发现高频LOH()50%),并且其在胃癌的发生发展中起着十分重要的作用;同时还发现在胃癌、食管癌及胰腺癌中,5q上LOH的发生频率远高于结肠腺瘤性息肉病(APC)基因的突变频率,提示5q染色体上存在APC基因外的另一种或多种TsG。其中,Tamura等[11]使用微卫星不稳定(MSI)标记的5q上的LOH范围为5q12~5q33.4;Kim等[12]所检测的5q染色体范围为5q11.213、5q14-15、5q21-22、5q32-33.2及5q32-33。本次实验所针对的FGFR4基因位于5q35.1,超出了上述研究中所标记的范围,LOH发生频率为92.31%(24/26),几乎是普遍发生,与既往的研究相比频率更高。本研究运用了SNP技术同时分析s351855所在的第9外显子区域其他位点的碱基突变情况,结果发现在发生第388密码子LOH的叫例患者中,第401密码子同时发生1例体细胞突变(R401C,C>T)。以上结果提示,在FGFR4基因Ⅱ351855位点附近存在TSG的缺失或失活,与胃癌的发生相关.本研究证实了胃癌中广泛存在FGFR4基因的Arg388密码子突变,该位点的LOH及SNP提示附近存在TSG的缺失或失活,有望成为胃癌早期诊断及防治的一个基因靶点,但需进一步研究来阐明FGFR4在胃癌细胞发生和发展过程中的作用。

4 参考文献

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