高糖对肝星状细胞增殖及对转化生长因子β1、血小板衍化生长因子和Ⅲ型前胶原表达的影响

　　作者：焦明丽,任莉,苌新明　　作者单位：1. 西安交通大学医学院第一附属医院消化内科，陕西西安

　　【摘要】 目的 研究高糖对肝星状细胞T6(HSCsT6)增殖及对转化生长因子β1(TGFβ1)、血小板衍化生长因子(PDGF)及Ⅲ型前胶原(PCⅢ)表达的影响。方法 设不同葡萄糖浓度组，观察30min～16h时间段，各组对HSCsT6分化、增殖的影响;并用免疫组织化学方法及放射免疫分析法在48、72h后测胞浆内TGFβ1、PDGF及细胞上清液中PCⅢ的表达。结果 在2～16h，1500～6000mg/L浓度葡萄糖对HSCsT6增殖具有时间依赖性，而在4500～6000mg/L浓度组更显著;同时在4500～6000mg/L浓度组，培养48h后胞浆中TGFβ1和PDGF表达较对照组和高渗对照组明显增加;培养72h后，细胞上清液中PCⅢ表达较对照组和高渗对照组明显增加。结论 高血糖可能通过刺激HSCsT6分泌TGFβ1、PDGF及PCⅢ促进肝纤维化。

　　【关键词】 肝星状细胞;转化生长因子;血小板衍化生长因子;Ⅲ型前胶原

　　Effects of high glucose on the proliferation of HSC andexpressions of TGFβ1, PDGF and PCⅢ in HSCs

　　JIAO Mingli, REN Li, CHANG Xinming

　　(1. Department of Gastroenterology, the First Affiliated Hospital,Medical School of Xian Jiaotong University, Xian 710061, China)

　　ABSTRACT: Objective To investigate the effects of high glucose on the proliferation of hepatic stellate cellT6 (HSCT6) and the expressions of transformation growth factorβ1 (TGFβ1), plateletderived growth factor (PDGF) and precollagen Ⅲ (PCⅢ). Methods Based on glucose groups of different concentration, we observed the proliferation of HSC in 30min-16h time period, and used the methods of immunohistochemistry and radioimmunoassay to measure the expressions of TGFβ1, PDGF and PCⅢ in the supernatant at 48h and 72h. Results In 2-16h time period, the proliferation of HSC was increased stepwise over time in 1500-6000mg/L group, and was more visible in 4500-6000mg/L group. The expressions of TGFβ1 and PDGF increased at 48h, and the expression of PCⅢ in the supernatant increased at 72h in 4500-6000mg/L group compared with that in glucose control and hypertonic control groups. Conclusion High glucose can promote hepatic fibrosis by stimulating the expressions of TGFβ1, PDGF and PCⅢ in HSCT6.

　　KEY WORDS: hepatic stellate cell (HSC); transformation growth factor (TGF); plateletderived growth factor (PDGF); precollagen Ⅲ (PCⅢ)

　　肝硬化可由多种病因引起，非酒精性脂肪肝是其常见原因之一，而糖尿病(diabetes mellitus, DM)则被认为是非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)的重要危险因素。临床研究表明，高血糖在NAFLD患者肝纤维化形成中起促进作用[12]。已证实高血糖能够诱导肝星状细胞(hepatic stellate cells, HSCs)中Ⅰ型胶原mRNA的表达，并诱导HSCs增殖[3];其诱导HSCs活化、增殖可能通过依赖转化生长因子(transformation growth factorβ, TGFβ)机制[4]、TGFβ激活p38有丝分裂原蛋白激酶通路起作用[5];在糖尿病时，葡萄糖可通过增加细胞内血小板衍化生长因子(plateletderived growth factor, PDGF)的敏感性引起TGFβ1翻译水平升高[6];Ⅲ型前胶原(precollagen Ⅲ, PCⅢ)在肝脏主要由肝星状细胞合成，其与肝纤维化形成活动程度密切相关。本试验运用不同浓度的葡萄糖刺激体外培养的HSCsT6，运用MTT方法检测HSCsT6的分化、增殖;并探讨高糖对HSCsT6产生TGFβ1、PDGF及PCⅢ的影响，进一步研究高糖在肝纤维化形成中的作用及其机制，以发现肝纤维化形成的新病因。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　肝星状细胞(HSCs)采用大鼠HSCsT6细胞株，由上海第二军医大学张俊平教授馈赠;MTT购自美国Sigma公司;多聚赖氨酸购自美国Sigma公司;兔抗大鼠TGFβ1抗体及兔抗大鼠PDGFBB抗体购自北京中杉生物工程有限公司;PCⅢ放免试剂盒购自北京401研究所。

　　1.2 试验分组

　　A组(对照组)：葡萄糖1000mg/L剂量组;B组：葡萄糖1500mg/L剂量组;C组：葡萄糖3000mg/L剂量组;D组：葡萄糖4500mg/L剂量组;E组：葡萄糖6000mg/L剂量组;F组(高渗对照组)：甘露醇6000mg/L剂量组。

　　1.3 试验方法

　　1.3.1 细胞复苏及培养

　　将冻存于液氮中的 HSC 取出迅速置37℃水浴解冻后移至超净台中，用移液管将细胞悬液移入离心管加入10倍以上普通DMEM(葡萄糖1000g/L)，1000r/min离心5min，除去上清液，加DMEM 5mL，将细胞吹打为混悬液并移至无菌培养瓶中置于5mL/L CO2细胞培养箱中培养至细胞贴壁。

　　1.3.2 MTT法检测细胞的增殖率

　　HSCs细胞贴壁长至单层90%～95%时，2.5g/L胰蛋白酶消化，以普通的DMEM(含100mL/L小牛血清、100IU/mL青霉素、100IU/mL链霉素及葡萄糖1000mg/L的培养液)调整细胞为1×105个/mL密度接种于96孔培养板，待HSCs细胞贴壁长至单层70%～80%时，换无血清的DMEM同步化细胞，每孔100μL继续培养24h。分别于培养结束前30min、1、2、4、8、16h加入A液、B液、C液、D液、E液和F液，同时设空白对照组，每组设6个复孔，试验重复3次。培养24h后，每孔加入MTT 20μL，37℃继续培养4h。终止培养后弃上清，每孔加入150μL DMSO溶解振荡，待结晶物充分溶解后(溶液呈蓝紫色)，置酶标仪上检测各孔吸光度值(表1)。

　　1.3.3 干预及细胞上清液的收集

　　将含普通的DMEM调整细胞为1×105个/mL密度接种于6孔培养板，待细胞贴壁后，将培养板中DMEM培养液倒出，换用A液、B液、C液、D液、E液和F液培养72h后，收集 HSC 培养上清液于EP管中-20℃冻存待检。后将收集的PCⅢ各组细胞上清液送同位素室，采用放射免疫分析法检测。所有检测均由专业技术人员严格按操作规程执行。　　1.3.4 细胞免疫化学染色

　　将HSCs悬液按2×105个/mL密度传代于6孔板内，使细胞混悬液覆盖盖玻片，换用A液、B液、C液、D液、E液和F液，每小孔中2mL，每组设3个小孔，培养48h后，当细胞出现明显形态变化，细胞贴壁于盖玻片生长至90%左右，停止干预用冷PBS轻柔冲洗细胞爬片3次，50g/L多聚甲醛固定30min，固定后的细胞爬片经内源性过氧化物酶灭活、抗原修复、羊血清非特异位点封闭后，分别加入兔抗大鼠TGFβ1及PDGF抗体孵育2h，再依次加入二抗试剂液孵育，后进行脱水、封片，镜下观察。采用HPIAS2000型多媒体彩色图像分析系统对染色阳性部位进行平均灰度值(average gray scale values, AGSV)的测定。

　　1.4 统计学处理

　　采用SPSS14.0统计软件，进行多组间比较，数据以均数±标准差(±s)表示，采用Oneway ANOVA和LSDt检验，α=0.05。

　　2 结 果

　　2.1 高糖对HSCs细胞增殖的影响

　　MTT法检测HSCs细胞增殖率结果表明：甘露醇组在30min～8h作用时间对HSCs增殖无明显影响;与各浓度组空白对照相比较：葡萄糖浓度≤3000mg/L时，在8～16h作用时间呈时间依赖性地刺激HSCs增殖，而在30min～4h作用时间对HSCs增殖无明显影响;而当葡萄糖浓度≥4500mg/L时，在2～16h作用时间呈时间依赖性地刺激HSCs增殖，而在30min～1h作用时间对HSCs增殖无明显影响(表1)。表1 不同浓度的葡萄糖对HSCs增殖的影响(略)

　　2.2 免疫组织化学方法检测各浓度组HSCs对TGFβ1和PDGF的表达

　　D组、E组分别与A及F组相比较，TGFβ1、PDGF的表达均升高，具有统计学意义(表2、图1、图2)。表2 HSCs产生的TGFβ1和PDGFBB免疫化学分析平均吸光度值(略)

　　2.3 放射免疫方法检测各组细胞上清液中PCⅢ的表达

　　将收集的各组细胞上清液采用放射免疫分析法检测PCⅢ的表达，结果显示D组(488.35±61.60)、E组(499.53±79.76)PCⅢ的表达较A组(288.05±0.68)、F组(311.79±38.20)均增高，具有统计学意义(P均<0.01)。

　　3 讨 论

　　目前，对DM的肾脏、神经、血管等病变的研究较多，肝脏病变研究较少，其发病机制是否相似尚不清楚。HSCs是肝脏细胞外基质的主要来源,其活化是肝纤维化形成的关键。活化的HSCs可以合成和分泌多种胶原酶和少量的ECM,释放多种细胞因子[7]参与肝脏的物质代谢。TGFβ是迄今发现的最强的肝纤维化促进剂[8],可促进ECM的表达[910]，抑制基质金属蛋白酶的合成，还能刺激肝星状细胞产生血小板衍化生长因子(PDGF)。PDGF是肝星状细胞的强有丝分裂原[11]，能促使肝星状细胞增殖、移行,诱导合成TGFβ1[12]。并且TGFβ1可引起细胞自分泌，加强细胞合成胶原，而大量产生的细胞外基质使肝纤维化过程不断加重，因此，TGFβ1可使肝星状细胞的激活处于一种正反馈的不断加强中[13]。研究表明，高糖可促进TGFβ的表达[14]，并且糖尿病患者体内TGFβ的表达是增加的[15]。PDGF主要由肝内枯否细胞和HSC产生，其中PDGFBB在刺激HSCs生长和相关细胞间信号传递方面更为重要[16]。PDGF对HSC的活化、分裂、增殖有明显的促进作用,且诱导HSCs合成TGF、胰岛素样生长因子(insulin like growth factor, IGF)等细胞因子。活化的HSCs分泌活性PDGF，又进一步刺激HSC活化,形成了PDGF自分泌循环。已证实，高糖环境能促进PDGF及其受体的表达[17]。高血糖能够诱导HSCs中Ⅰ型胶原mRNA的表达以及HSCs增殖;其诱导HSCs活化、增殖及胶原分泌可能通过依赖TGFβ机制、TGFβ激活p38有丝分裂原蛋白激酶通路起作用;TGFβ1可诱导HSC释放的CTGF高表达，后者能促进HSC对Ⅰ、Ⅲ型胶原、LN、金属蛋白酶抑制剂(tissue inhibitor of metalloproteinases, TIMPs)和TGFβ1的高表达而促进了纤维化的形成。

　　本实验通过不同浓度的葡萄糖刺激体外培养HSCsT6，结果显示：在2～16h，1500～6000mg/L浓度葡萄糖对HSCsT6分化、增殖具有时间依赖性，在4500～6000mg/L浓度更显著。这表明在短期内高糖能够刺激HSCsT6分化、增殖，且增殖程度与葡萄糖作用时间呈正相关;HSCsT6在高糖环境中培养48h后，高浓度组(4500～6000mg/L)胞浆中TGFβ1和PDGF表达较对照组和高渗对照组明显增加;其在高糖环境中培养72h后，高浓度组(4500～6000mg/L)细胞上清液中PCⅢ表达较对照组和高渗对照组明显增加。表明HSCsT6分泌TGFβ1、PDGF及PCⅢ的量与葡萄糖浓度呈正相关，并能在短时间内发挥作用。考虑高血糖作为糖尿病的重要表现可能通过刺激HSC活化并大量分泌TGFβ1、PDGF及PCⅢ从而促进肝纤维化的形成。同时为排除高渗状态对HSCsT6分泌胶原、细胞因子产生的影响，另设立甘露醇组作为高渗对照组，通过比较发现HSCsT6分泌胶原、细胞因子量的增加与干预液的渗透压无关。

　　本实验虽初步证实了高糖有致肝纤维化的作用，但仍有待于进一步从分子水平，通过研究细胞内信号转导通路等途径，来证实这一理论，使研究进入一个较深的层次。

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