CYP2E1RsaⅠ、GSTT1基因多态性与胰腺癌遗传易感性的病例对照研究
发表时间：2012-02-27 浏览次数：365次
作者：张超贤,郭晓凤,许晓芳 作者单位：1. 新乡医学院第一附属医院消化内科，河南卫辉 453100;2. 杭州市第六人民医院，浙江杭州 310014;3. 郑州大学第五附属医院消化内科，河南郑州 450052
【摘要】 目的 探讨吸烟和细胞色素P4502ElRsaⅠ(CYP2E1RsaⅠ)、谷胱甘肽硫转移酶T1(GSTT1)基因多态性与胰腺癌发病之间的关系。方法 采用病例对照研究的方法，以150例胰腺癌患者及150例非癌对照者的外周血白细胞为样本，利用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)技术分析了Ⅰ相代谢酶CYP2E1RsaⅠ和Ⅱ相代谢酶GSTT1基因多态性。结果 CYP2E1RsaⅠ野生纯合型(c1/c1)和GSTT1基因缺陷型[GSTT1(-)]频率分布分别为38.7%、69.3%(病例组)和20.7%、44.7%(对照组)，二者经χ2检验差异有显著性(χ2=15.75，P<0.01;χ2=18.62，P<0.01)。c1/c1基因型者患胰腺癌的风险显著增加(OR=3.19，95% CI=2.53～4.26)。GSTT1(-)者患胰腺癌的风险也显著增加(OR=2.85，95% CI=1.92～4.64)。基因突变的协同分析发现CYP2E1RsaⅠ(c1/c1)/GSTT1(-)在胰腺癌组和对照组中的分布频率分别为30.7%和6.7%，二者经χ2检验有显著性差异(χ2=42.39，P<0.01)。CYP2E1RsaⅠ(c1/c1)/GSTT1(-)患胰腺癌的风险显著增加(OR=16.63，95% CI= 8.94～22.01)。病例组的吸烟率显著高于对照组的吸烟率(OR=2.74，95% CI=1.32～4.58，P<0.01)，CYP 2E1RsaⅠ(c1/c1)及GSTT1(-)与吸烟有协同作用(OR=8.84，95% CI=5.51～11.62;OR=20.40，95% CI=4.98～29.53)。结论 CYP2E1RsaⅠ(c1/c1)和GSTT1(-)是胰腺癌的易患因素，二者对胰腺的发生有协同作用，吸烟与胰腺的易感性也有关，CYP2E1RsaⅠ(c1/c1)、GSTT1(-)与吸烟在胰腺癌的发生上也有相互促进作用。
【关键词】 胰腺癌,细胞色素P4502ElRsaⅠ(CYP2E1RsaⅠ);谷胱甘肽硫转移酶T1(GSTT1);多态现象;吸烟
ABSTRACT: Objective To investigate the correlation between the combination of smoking with CYP2E1RsaⅠ and GSTT1 genes polymorphisms and pancreatic cancer. Methods The genetic polymorphisms of CYP2E1RsaⅠ and GSTT1 were analyzed by polymorphismpolymerase chain reaction (PCR) technique in peripheral blood leukocytes of 150 pancreatic cancer cases and 150 noncancer controls. Results The frequency of CYP2E1RsaⅠ(c1/c1) and GSTT1(-) was 38.7% and 69.3% in pancreatic cancer cases and 20.7% and 44.7% in healthy controls, respectively. Statistical tests showed significant differences in the frequencies between the two groups (χ2=15.75, P<0.01; χ2=18.62, P<0.01). The risk of pancreatic cancer patients with CYP2E1RsaⅠ(c1/c1) was significantly higher than that of controls (OR=3.19, 95% CI=2.53-4.26). The individuals who carried with GSTT1(-) had a higher risk of pancreatic cancer (OR=2.85, 95% CI=1.92-4.64). Combined analysis of the polymorphisms showed that the percentage of CYP2E1RsaⅠ(c1/c1)/GSTT1(-) in pancreatic cancer and control groups was 30.7% and 6.7%, respectively (χ2= 42.39, P<0.01). People who carried with CYP2E1RsaⅠ(c1/c1)/GSTT1(-) had a higher risk of pancreatic cancer (OR=16.63, 95% CI=8.94-22.01). The smoking rate was significantly higher in the case group than in the control group (OR=2.74, 95% CI=1.32-4.58, P<0.01), and statistical analysis suggested an interaction between smoking and CYP2E1RsaⅠ(c1/c1) or GSTT1(-) genotypes polymorphisms which increased the risk of pancreatic cancer (OR=8.84, 95% CI=5. 51-11.62; OR=20.40, 95% CI=4.98-29.53). Conclusion CYP2E1RsaⅠ(c1/c1) and GSTT1(-) are the risk factors in pancreatic cancer. Smoking is also related to the susceptibility to pancreatic cancer. There may be a synergetic interaction among CYP2E1RsaⅠ(c1/c1) and GSTT1(-) and smoking on the elevated susceptibility of pancreatic cancer.
KEY WORDS: pancreatic cancer; CYP2E1RsaⅠ; GSTT1; polymorphism; smoking
胰腺癌是消化系统常见的恶性肿瘤。近年来胰腺癌发病率明显增高，其恶性程度高，5年生存率<5%，死亡率接近于发病率。胰腺癌的发病同多数恶性肿瘤一样，是环境因素与遗传因素共同作用的结果。迄今为止，其确切病因尚不清楚。目前，仅吸烟已经被证实为胰腺癌的危险因素[1]，吸烟者患胰腺癌的风险是无吸烟者的两倍[2]，香烟中的多环芳烃、杂环胺和亚硝胺类物质均是作用明确的化学致癌物。且已知大多数的化学致癌物在体内都需要生物转化激活或解毒，此过程涉及的代谢酶分为两类：即Ⅰ相代谢酶和Ⅱ相代谢酶。Ⅰ相代谢酶为代谢活化酶，许多前致癌物经过代谢活化成为终致癌物。Ⅱ相代谢酶为代谢解毒酶，可以把致癌物或其毒性代谢产物转化成对人体无害的物质并排除体外，致癌物能否引起靶细胞癌变很大程度上取决于这两类酶的活性及彼此的平衡关系。代谢酶的基因大多具有多态性，某些基因的多态性可引起酶活性的改变，从而导致个体肿瘤易感性的差异。代谢酶基因多态性与吸烟相关性肿瘤(如食管癌、肺癌、直结肠癌)的关系是近年来国内外研究的热点。但是，关于胰腺癌与代谢酶基因多态性的相关性研究国内尚只见综述性报道。本文拟通过对150例胰腺癌患者吸烟和Ⅰ相代谢酶CYP2E1RsaⅠ、Ⅱ相代谢酶GSTT1基因多态性的调查,探讨吸烟和CYP2E1RsaⅠ、GSTT1基因多态性与胰腺癌的相关性,为胰腺癌的病因研究和遗传易感性研究提供依据。
1 材料与方法
1.1 研究对象及相关资料
2007年6月至2009年5月在我院收治的胰腺癌患者150例，其中男103例，女47例;平均年龄(55.43±6.58)岁;病理学确诊均为原发性胰腺导管腺癌。对照组150例来自与胰腺癌组同期住院非肿瘤、非遗传性疾病的患者，其中男99例，女51例;平均年龄(53.47±7.62)岁，两组在年龄、性别、民族、籍贯统计学处理差异无显著性，无血缘关系，调查收集研究对象的人口学资料、吸烟史、职业史和家族肿瘤史。每人各抽取静脉血2～3mL，置乙二胺四乙酸钠抗凝管,分离白细胞层。用QIAamp DNA提取试剂盒提取白细胞DNA，DNA置-30℃低温冰箱保存备用。
1.2 CYP2EIRsaⅠ多态性分析
采用美国ABI公司的Gene Amp9700型PCR扩增仪进行PCR扩增。采用基于PCR的限制性片段长度多态检测(PCRRFLP)的方法检验CYP2El基因RsaⅠ多态性。参照文献报道[34]，设计引物序列。CYP2E1基因RsaⅠ位点上、下游引物序列为：5′TTCATTCTGTCTTCTAACTGG3：5′CCAGTCGAGTCTACATTGTCA3。PCR反应体系总体积各为25μL，含10×PCR反应缓冲液2.5μL、25mmol/L MgC12 2μL、2mmol/L 4×dNTP 2.5μL、基因组DNA 3μL、5U/μL Taq DNA聚合酶0.3μL、20μmol/L RsaⅠ位点引物0.5μL、加双蒸水补充总体积至25μL。PCR反应条件为：94℃预变性4min;94℃ 1min、63℃ 1min、72℃ 1min，35个循环;72℃延伸10min。PCR扩增产物经限制性内切酶RsaⅠ酶切后，于琼脂糖凝胶电泳分析基因型。
1.3 GSTT1多态性分析
用多重PCR技术同时检测GSTT1基因，βglobin为内对照。参照有关文献[5]，分别构建GSTT1、βglobin基因扩增引物，扩增GSTT1的引物分别为：5′TCTCCTTACTGGTCCTC ACATCTC3′和5′TCACCGGATCATGGCCAGCA3′;
扩增βglobin引物分别为5′CAACTTCATCCACGTTCACC3′和5′GAAGAGCCAAGGACAGGTAC3′。引物由上海Sangon公司合成(PAGE纯化)。PCR体系为25μL：其中10×buffer 2.5μL，4×dNTPs 1μL，25mmol/L MgC12 3μL，50μmol/L引物1μL。95℃变性5min;35个循环(95℃ 45s，58℃ 45s，72℃ 45s)，72℃延伸10min。取5μL PCR扩增产物作20g/L琼脂糖凝胶电泳。加入DL，2000分子量Marker，40min后于紫外透射分析仪上观察结果。
1.4 统计方法
采用SPSS for Windows 11.0统计软件包进行统计分析。分别计算病例组和对照组的GSTT1和CYP2E1RsaⅠ基因型分布，两组间的差异采用四格表χ2检验，各基因型胰腺癌风险的调整OR值及其95%可信区间(95% CI)通过非条件Logistic回归模型后，GSTT1和CYP2E1RsaⅠ之间的联合作用及两者与吸烟的联合作用经Logistic回归模型计算。
2 结 果
2.1 CYP2EIRsaⅠ和GSTT1检测结果的判断
CYP2E1基因RsaⅠ酶切位点扩增片段长度为410bp，扩增产物经RsaⅠ内切酶消化后分为三种基因型：纯合子野生型(cl/c1)、杂合子型(cl/c2)、纯合子突变型(c2/c2)。其中cl/c1型可被RsaⅠ内切酶完全酶切，凝胶电泳可见360bp，50bp两条带;cl/c2型可被RsaⅠ内切酶部分酶切，可见360bp、50bp、410bp三条带;c2/c2型不能被RsaⅠ内切酶酶切，只见410bp一条带(图1)。GSTT1 DNA样本经PCR扩增后产生480bp片段者为GSTTl(+)，在无相应扩增产物者为纯合子基因缺失GSTT1(-)，内对照βglobin扩增片断为268bp(图2)。
2.2 CYP2E1RsaⅠ、GSTT1基因型的分布情况
胰腺癌组CYP2E1RsaⅠ(cl/c1)基因型有58例(38.7%)，c1/c2基因型有51例(34.0 %)，c2/c2基因型41例(27.3%)，而对照组三种基因型分别为31例(20.7%)、49例(32.7%)、70例(46.6%)，差异有显著性(P<0.01)，胰腺癌组与对照组GSTT1(-)各占69.3%和44.7%，差异有显著性(P<0.01，表1)。表1 胰腺癌组与对照组CYP2E1RsaⅠ、GSTT1基因型的多态性分布(略)
2.3 CYP2E1RsaⅠ、GSTT1基因型与胰腺癌易感性的协同分析
CYP2E1RsaⅠ(c1/c1)/GSTT1(-)在胰腺癌组占30.7%，而对照组仅占6.7%，基因组合CYP2E1RsaⅠ(c1/c1)/GSTT1(-)的胰腺癌患病比例是CYP2E1RsaⅠ(c1/c1)/GSTT1(+)的8.05(46×21/12×10) 倍，是CYP2E1RsaⅠ(c2/c2)/GSTT1(-)的3.78(46×23/28×10)倍(表2)。表2 CYP2E1RsaⅠ和GSTT1基因型与胰腺癌易感性的协同分析(略)
2.4 胰腺癌的易感性与吸烟的相关分析
将正常对照组的吸烟人数和不吸烟人数与胰腺癌组的吸烟人数和不吸烟人数进行χ2检验，结果表明胰腺癌的发生与吸烟有关，吸烟者容易患胰腺癌(OR=2.74，95% CI=1.32～4.58，P<0.01，表3)。表3 胰腺癌易感性与吸烟的相关分析(略)
2.5 CYP2E1RsaⅠ基因型和吸烟与胰腺癌易感性的协同分析
胰腺癌组中携带CYP2E1RsaⅠ(c1/c1)基因和吸烟者明显较对照组多，CYP2E1RsaⅠ(c1/c1)吸烟者占胰腺癌组的36.0%，而在对照组中仅14.0%，有显著性差异(P<0.01，表4)。表4 CYP2E1RsaⅠ基因型和吸烟与胰腺癌易感性的协同分析(略)
2.6 GSTT1基因型和吸烟与胰腺癌易感性的协同分析
胰腺癌组中GSTT1(-)吸烟者明显高于对照组，GSTT1(-)吸烟者占胰腺癌组的42.7%，而在对照组中仅4.7%，有显著性差异(P<0.01，表5)。表5 GSTT1基因型和吸烟与胰腺癌易感性的协同分析(略)
3 讨 论
胰腺癌的发生是遗传因素和环境因素共同作用的结果。吸烟是目前唯一获得公认的胰腺癌的病因。大多数环境致癌物在体内都需要代谢激活后才有致癌性，而烟草中的许多前致癌物同样需要经过体内Ⅰ相和Ⅱ相代谢酶的活化和解毒。CYP2E1是重要的Ⅰ相代谢酶之一，CYP2E 1基因定位于10q24.3qter，由9个外显子和8个内含子共11413个碱基组成。其cDNA长度为1497bp。它所编码的二甲基亚硝胺D脱甲基酶是体内代谢激活烟草中亚硝胺类化合物的主要酶类。烟草中的几种前致癌物如N硝基去甲烟碱(NNN)、4甲基尼古酰基1吡啶基1丁酮(NNK)等都需要CYP2E1的激活[6]。近年来的研究显示， CYP2E1基因存在6个限制性酶切位点，包括TaqⅠ、DraⅠ、RsaⅠ、MSPIRFLP以及位于5′转录调控区连锁的PastⅠ和RasⅠRFLP位点[7]，但只有位于第6内含子的DraⅠ和5′非编码区的RsaⅠ位点的多态性可影响CYP2E1的表达[8]。DraI多态性发生在内含子6，包括野生基因型DD、杂合基因型DC和纯合突变基因型CC三种基因型。该位点的变化不会造成氨基酸序列和蛋白质结构的改变。它对CYP2E1酶活性的影响目前尚不清楚。RsaⅠ多态位点位于CYP2E1基因的转录调节区，它的纯合野生基因型、杂合基因型和纯合突变基因型分别被称为c1/c1基因型、cl/c2基因型和c2/c2基因型。CYP2E1的转录激活区域位于5′端，而RasⅠ多态位点正好位于转录因子HNF1结合区域，可能影响基因的表达水平。国内外已有研究报道认为RsaⅠ位点的多态性与食管癌、胃癌和肺癌等肿瘤的易感性有关[910]。本研究发现CYP2E1RsaⅠ(c1/c1)和(c1/c2)基因型者发生胰腺癌的风险显著增加(OR=3.19，95% CI=2.53～4.26;OR=1.78，95% CI=0.97～3.05)。与上述研究结果一致。CYP2E1RsaⅠ(c1/c1)和(c1/c2)基因型者易患胰腺癌的机制还不清楚。相关研究均说明c1基因型的酶活性高于c2基因型。因此，c1/c1和c1/c2基因型者易患胰腺癌的原因可能是此种基因型者体内CYP2E1活性高，可产生更多的活性致癌物。
谷胱甘肽转硫酶(glutathione Stranferase, uGSTs)属Ⅱ相代谢酶，能催化亲电子致癌物与谷胱甘肽结合，形成易溶解于水的化合物排出体外，是与毒物或致癌物的解毒代谢有关的酶类。GSTT1、GSTM1基因分别编码GSTθ、GSTμ两亚型，且具有基因多态性，其无效基因型，即缺失基因型GSTT1(-)、GSTM1(-)可引起相应的酶表达缺失或活性降低，导致解毒功能的改变，从而增加特定肿瘤发病率[11]。国内外研究证明GSTT1、GSTM1基因多态性与多种肿瘤风险相关[1213]。GSTT1与GST家族其他成员不同。它不仅存在于肝中，还存在于红细胞中，使得红细胞成为一个解毒场所，被认为在人体致癌物解毒方面，比GSTM1承担着更重要的角色。它主要涉及低相对分子质量毒物的转化，如催化天然及一些工业合成卤代烷烃类的结合代谢，也在烟草的环氧丁烷、烃类氧化物及农药的致癌物如环甲烷、甲基淀化物的解毒第二时相中发挥作用。GSTT1编码酶的缺失导致其相应作用底物的解毒障碍，增加人群暴露于上述致癌毒物的危险性。
本研究发现GSTT1(-)与胰腺癌的发生有关，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)，携带GSTT1(-)基因者患胰腺癌的风险高于携带GSTT1(+)的个体(OR=2.85，95% CI=1.92～4.64)，GSTT1(-)与CYP2E1RsaⅠ(c1/c1)对胰腺癌的发生有显著的协同作用，兼有GSTT1(-)和CYP2E1RsaⅠ(c1/c1)型者胰腺癌发生率是兼有GSTT1(+)和CYP2E1RsaⅠ(c1/c1)型胰腺癌发生率的8.05倍。此外，本研究发现吸烟与胰腺癌的易感性有关(OR=2.74，95% CI=1.32～4.58，P<0.01)。对CYP2EIRsaⅠ和GSTT1基因型与吸烟关系的协同分析发现，在胰腺癌患者中携带 CYP2EIRsaⅠ(c1/c1)型基因且吸烟、GSTT1(-)基因且吸烟的人较对照组多，经统计学检验差异有显著性(P<0.01)。CYP2EIRsaⅠ(c1/c1)型吸烟者发生胰腺癌的危险显著增加(OR=8.84，95% CI=5.51～11.62)，GSTT1(-)吸烟者胰腺癌发生的危险也显著增加(OR=20.40，95% CI=4.98～29.53)。本研究结果表明，GSTT1(-)与CYP2E1RsaⅠ(c1/c1)和吸烟在胰腺癌的发生上也有相互促进作用，能显著增加胰腺癌的危险性。
总之，GSTT1(-)与CYP2E1RsaⅠ(c1/c1)基因型有可能增加胰腺癌的危险性，尤其在两者的联合作用时表现得更为显著;环境暴露因素吸烟和代谢酶基因多态性也表现出增加胰腺癌危险性的联合作用。提示我们，今后开展相关研究应该从两个方面进行，一是从代谢酶基因多态性出发，考虑代谢酶基因多态性之间的联合作用;二是在研究代谢酶基因与肿瘤的关系时，不能忽略与环境暴露因素的联合作用。
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