手术操作与胃癌微转移的关系

　　作者：辛桂霞　　作者单位：潍坊市人民医院消化内科，山东 潍坊 261041

　　【摘要】目的 探讨手术操作与胃癌微转移的关系。方法 采用巢式逆转录聚合酶链式反应(RTPCR)技术检测70例胃癌病人手术前、后外周血细胞角蛋白(CK20) mRNA及癌胚抗原(CEA) mRNA的表达情况，并以20例健康志愿者作为阴性对照组，以10例胃癌组织作为阳性对照组。结果 CK20 mRNA及CEA mRNA在术前阳性表达率分别为32.9%和51.4%，而术后二者的阳性表达率分别为62.9%和70.0%，术后阳性率明显高于术前(χ2=12.62、5.06，P<0.05)。20例健康志愿者无1例阳性表达。结论 手术操作可以促使胃癌发生微转移。

　　【关键词】 胃肿瘤,肿瘤转移,角蛋白,癌胚抗原 逆转录聚合酶链反应

　　[ABSTRACT]ObjectiveTo study the relationship between surgical maneuvers and micrometastasis of gastric cancer.MethodsUsing nested reverse transcription polymerase chain reaction, the expressions of CK20 mRNA and CEA mRNA in peripheral blood were determined in 70 gastric cancer patients, before and after operation. Twenty healthy volunteers served as positive controls.ResultsOf 70 patients operated, the expressions of CK20 mRNA and CEA mRNA were 32.9% and 51.4%, respectely preoperatively; while postoperatively, they were 62.9% and 70.0%(χ2=12.62,5.06;P<0.05). No positive expressions were noted in healthy controls.ConclusionSurgical maneuvers may cause micrometastasis in gastric cancer.

　　[KEY WORDS]Gastric neoplasms; Neoplasm metastasis; Keratin; Carcinoembryonic antigen; Reverse transcriptase polymerase chain reaction

　　关于手术操作能否引起肿瘤病人血循环中的微转移，以及后期与肿瘤复发及转移的关系，目前尚存在争议。本研究以细胞角蛋白(CK20)及癌胚抗原(CEA)为肿瘤标志物，采用巢式逆转录聚合酶链式反应(RTPCR)技术，检测胃癌病人手术前、后外周血中二者mRNA的表达情况，探讨手术操作与胃癌微转移的关系。

　　1 材料和方法

　　1.1 标本采集

　　2004年4月～2005年4月，在本院肿瘤外科经胃镜和病理检查确诊并准备进行手术治疗的胃癌病人70例，其中男51例，女19例;年龄35～83岁，中位年龄61.8岁。取手术前、后肘静脉血各3 mL，置于无菌EDTA2Na防凝的试管中待测。另以20例健康志愿者作阴性对照，以胃腺癌细胞株BGC823(由上海细胞研究所细胞库提供)作阳性对照。

　　1.2 主要试剂

　　引物参考文献[1，2],由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列如下。CK201 primer: 5′CAGACACACGGTGAACTATGG3′，CK202 primer:5′GATCAGCTTCCACTGTTAGACG3′，CK203primer:5′CTGTTTGTTGGCAATGAGAAAATGG3′，CK204 primer: 5′GTATTCCTCTCTCAGTCTCATACT3′;CEA1 primer: 5′TCTGGAACTTCTCCTGGTCTCTCAGCTGG3′，CEA2 primer:5′TGTAGCTGTTGCAAATGCTTTAAGGAAGAAGC3′，CEA3 primer: 5′GGGCCACTGTCGGCATCATGATTGG3′;βactin forward primer:5′CCCTGGACTTCGAGCAAGAGAT3′， reverseprimer:5′GTTTTCTGCGCAAGTTAGG3′。实验所用RTPCR试剂盒及Trizol试剂均购自加拿大Sangon公司。

　　1.3 检测方法

　　1.3.1 有核细胞及总RNA的提取

　　取3 mL采用EDTA2Na抗凝的外周静脉血，加入等体积淋巴细胞分离液分离单个核细胞。Trizol一步法抽取细胞总RNA，聚丙烯酰胺凝胶电泳观察RNA片段大小及纯度。

　　1.3.2 逆转录反应合成cDNA

　　取1.5 μg细胞总RNA，70 ℃ 60 min变性后，根据试剂盒说明进行cDNA合成。

　　1.3.3 巢式RTPCR扩增

　　CEA扩增的第一轮引物为1和2，扩增条件： 95 ℃预变性5 min;94 ℃变性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸 1 min，循环30次;最后72 ℃延伸5 min。接着进行第二轮扩增，引物为3和2，扩增条件： 95 ℃预变性5 min;94 ℃变性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，循环30次;最后72℃ 延伸5 min。CK20扩增的第一轮引物为1和2，扩增条件：93 ℃预变性8 min;94 ℃变性30 s，63 ℃退火1 min，72 ℃延伸 1 min，循环30次;最后72 ℃延伸5 min。接着进行第二轮扩增，引物为3和2，扩增条件：93 ℃预变性8 min;94 ℃变性30 s，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸 1 min，循环30次;最后72 ℃延伸5 min。βactin循环条件：95 ℃变性1 min，60 ℃退火1 min，70 ℃延伸1 min，共35个周期。

　　1.4 结果观察

　　取PCR终产物10 μL在聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，硝酸银显色，紫外线下观察结果，记录结果并拍照。

　　1.5 统计学分析

　　采用χ2检验。

　　2 结果

　　结果表明：BGC823胃腺癌细胞株CK20 mRNA及CEA mRNA均为阳性表达;20例健康志愿者外周血CK20 mRNA 及CEA mRNA均为阴性表达;所有标本都扩增出了内参对照βactin，片段大小为552 bp，说明本实验方法可靠。

　　胃癌病人术后外周血CK20 mRNA阳性表达率为62.9%(44/70)，明显高于术前的阳性表达率32.9%(χ2=12.62，P<0.05)。胃癌病人术后外周血CEA mRNA的阳性表达率为70.0%(49/70)，明显高于术前阳性表达率51.4%(χ2=5.06，P<0.05)。

　　3 讨 论

　　为研究手术操作所导致的进入循环中的癌细胞与肝转移的关系，MIYAZONO等[3]采用RTPCR技术检测57例接受手术的胃癌病人，抽取手术前、后外周静脉血作为检测标本，结果显示，术后CEA mRNA的阳性表达率明显高于术前，认为手术操作可能是导致肿瘤细胞释放入血的一个原因，随后经过追踪观察发现，术后CEA mRNA阳性的病人发生后期肿瘤转移的危险性明显高于阴性者。GARCIAMO等[4]报道，手术操作对结肠癌病人癌细胞入血并无直接的关系，采用不接触肿瘤的分离技术对病人的术后生存率也没有显著的影响。而张海平等[5]研究结果则显示，消化系肿瘤病人行根治术后CEA、CA199、CA242三种肿瘤标志物的阳性表达率手术后较手术前显著降低。

　　本文实验结果显示，70例胃癌病人术后CK20 mRNA、CEA mRNA的阳性表达率分别为62.9%、70.0%，明显高于术前。这说明手术操作可能促使肿瘤细胞进入血循环，与国外部分学者报道一致。

　　虽然手术操作引起释放入血的癌细胞不一定引起后期的远处转移，但由于围手术期病人体质较弱，免疫功能较低下，增加了循环癌细胞逃避免疫监视成为转移灶的机会，因而手术时应注意癌细胞的播散问题，尽量采取不接触肿瘤的分离技术，如去血管的肿瘤清扫术，从而最大程度降低手术时医源性癌细胞播散的可能性。同时，作者认为术后加以积极的化疗，对阻止肿瘤的复发和转移也会有重要的作用。但手术期间释放入血的癌细胞是否影响病人的复发与转移，由于本实验标本例数和观察时间的关系，还需进一步观察研究。

　　【参考文献】

　　[1]FUNAKI N O, TANAKA J, OHSHIO G, et al. Cytokeratin 20 mRNA in peripheral venous blood of colorectal carcinoma patients[J]. Br J Cancer, 1998,77(8):13271332.

　　[2]SCHREWE H, THOMPSON J, BONA M, et al. Cloning of the complete gene for carcinoembryonic antigen: analysis of its promoter indicates a region conveying cell typespecific expression[J]. Mol Cell Biol, 1990,10(6):27382748.

　　[3]MIYAZONO F, NATSUGOE S, TAKAO S, et al. Surgical maneuvers enhance molecular detection of circulating tumor cells during gastric cancer surgery[J]. Ann Surg, 2001,233(2):189194.

　　[4]GARCIAMO D, ONTANON J, GARCIAOLMO D C, et al. Experimental evidence does not support use of the “notouch” isolation technique in colorectal cancer[J]. Dis Colon Rectum, 1999,42(11):14491456.