5杂氮2脱氧胞苷对BGC823胃癌细胞株RIZ1基因去甲基化转录调控作用

　　作者：王芳,卢启明　　作者单位：1 兰州大学临床医学院, 2 甘肃省人民医院消化科, 甘肃 兰州 730000

　　【摘要】目的: 探讨5杂氮2脱氧胞苷(5AzaCdR)对人胃癌细胞系BGC823细胞株RIZ1基因的去甲基化转录调控作用及对细胞株生长增殖的影响，寻找胃癌治疗的新靶点. 方法: 使用3种不同浓度5AzaCdR干预胃癌BGC823细胞，甲基化特异性PCR(MSP)和逆转录聚合酶链反应(RTPCR)检测药物干预前后RIZ1基因的甲基化状态和RIZ1 mRNA的表达;MTT法检测细胞增殖活性，流式细胞术分析细胞周期及细胞凋亡的改变.结果: 未经5AzaCdR处理的BGC823细胞中RIZ1基因启动子区域CpG岛高甲基化，且RIZ1 mRNA不表达，经2，5，10 μmol/L 5AzaCdR处理48 h后，RIZ1基因启动子区域高甲基化得到逆转，细胞中均有RIZ1 mRNA表达，相对定量值分别为0.509，0.716，0.831;3种浓度5AzaCdR处理BGC823细胞后，与对照组比较，细胞增殖速度出现不同程度减慢(P<0.05)，随着浓度的增加其抑制作用增强;并显著抑制BGC823细胞生长周期,与对照组相比，G0/G1期细胞数增加，S期细胞数减少，细胞凋亡率明显升高(P<0.05). 结论: 5AzaCdR能有效逆转胃癌BGC823细胞RIZ1基因的异常甲基化，从而激活因高甲基化导致RIZ1基因沉默的再转录，诱导该基因的表达，抑制肿瘤细胞生长.

　　【关键词】 胃肿瘤,肿瘤细胞,培养的 5杂氮2′脱氧胞苷 RIZ1基因 DNA甲基化

　　0引言

　　抑癌基因失活是胃癌发生的重要原因，多种抑癌基因由于启动子区域CpG岛高甲基化而导致其失活已得到广泛证实. DNA甲基转移酶抑制剂5杂氮2脱氧胞苷(5AzaCdR)通过抑制甲基化酶，可使多种启动子区域高甲基化的抑癌基因重新表达或表达增高[1]. RIZ基因(Rb interacting zinc finger gene)是Buyse等[2]对可与Rb结合的蛋白质进行功能性筛选时分离出的，定位于人染色体1p36. 能够产生两种交替出现的蛋白产物RIZ1和RIZ2. RIZ1基因是一种新型肿瘤抑制基因，在胃癌中对该基因的研究，国内少见报道. 为研究胃癌中该基因的甲基化状态及CpG岛去甲基化后其转录活性的表达，我们应用5AzaCdR对BGC823细胞进行处理，观察RIZ1基因转录表达情况及细胞生物学特性的改变，从而为胃癌的临床治疗提供分子水平依据.

　　1材料和方法

　　1.1 材料人胃癌细胞株BGC823由兰州大学基础医学院病理学分子生物学实验室馈赠;RPMI1640(Gibco公司);5AzaCdR(Sigma公司)，用PBS充分溶解后配制成1 mol/L的母液，-20℃保存. EZ DNA MethylationGold Kit(北京天漠科技开发有限公司), AMV第1链cDNA试剂盒及PCR扩增试剂盒(上海生工生物工程有限公司);Trizol试剂(Invitrogen公司);引物合成(大连宝生物工程有限公司)，MTT及PI(Sigma公司).

　　1.2方法

　　1.2.1细胞培养和干预将BGC823细胞用含100 mL/L小牛血清、100 ku/L青霉素和100 ku/L链霉素的RPMI1640培养液，在50 mL/L CO2浓度，37℃、湿度饱和的条件下培养. 另配制含2,5,10 μmol/L 5AzaCdR的完全培养液. 取传代后24 h的细胞，分别加入含3种不同5AzaCdR浓度的完全培养液，根据实验要求，培养48,72 h后回收细胞. 对照组使用不含5AzaCdR的普通完全培养液.

　　1.2.2MSP法检测5AzaCdR干预前后BGC823细胞中RIZ1基因甲基化状态取对照组和药物干预48 h后BGC823细胞，应用饱和酚氯仿法抽提细胞基因组DNA，紫外分光光度计检测DNA纯度及含量. 取20 μg DNA，参照EZ DNA MethylationGold Kit说明书对基因组DNA行亚硫酸氢盐修饰. 以亚硫酸氢盐修饰后DNA为模板，使用甲基化扩增试剂盒分别用甲基化引物和非甲基化引物进行PCR扩增，所有PCR扩增均使用25 μL反应体系. 引物参考文献[3]，甲基化引物：上游5′GTG GTG GTT ATT GGG CGA CGG C3′，下游：5′GCT ATT TCG CCG ACC CCG ACG3′，扩增片段为177 bp，PCR反应条件：95℃变性10 min，94℃变性30 s，68℃退火45 s，72℃延伸60 s，共40个循环后，72℃延伸6 min; 非甲基化引物：上游5′TGG TGG TTA TTG GGT GAT GGT3′，下游5′ACT ATT TCA CCA ACC CCA AGA3′，扩增片段为175 bp, PCR反应条件：95℃变性10 min，94℃变性30 s，60℃退火45 s，72℃延伸60 s，共40个循环后，72℃延伸6 min. PCR扩增产物于15 g/L琼脂糖凝胶电泳，呈像观察.

　　1.2.3两步法RTPCR检测5AzaCdR干预前后BGC823细胞中RIZ1基因的表达取对照组和药物干预48 h后BGC823细胞，用Trizol试剂提取细胞总RNA，参照AMV第1链cDNA试剂盒说明书操作合成cDNA，以Oligo dT为引物反转录. RIZ1特异引物进行PCR扩增，以GAPDH作为内参照. RIZ1引物由Oligo5.0软件设计：上游5′AAG GGG AAG CAG ATG ATG TG3′ ，下游5′TGG TCC GCC TCT TAA ACC TA3′，扩增片段为576 bp;GAPDH引物：上游5′TTC TCC CCA TTC CGT CTT CC 3′ ，下游5′GTA CAT GGT ATT CAC CAC CC3′，扩增片段为435 bp. RIZ1引物序列与GAPDH引物序列PCR反应条件相同：94℃变性5 min，95℃变性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸60 s，共35个循环后，72℃延伸5 min. PCR扩增产物于15 g/L琼脂糖凝胶电泳，呈像观察.

　　1.2.4MTT法检测5AzaCdR作用于BGC823细胞后对细胞增殖的影响取对数生长期细胞后常规消化，按每孔2×107个/L种入96孔板，100 μL/孔，实验组5AzaCdR的终浓度分别为2，5，10 μmol/L，每组设3个复孔，对照组加等量的PBS，共接种6板，每日取出1板加入5 g/L MTT液10 μL，37℃孵育4 h后弃去上清液，PBS洗涤2次，每孔加入二甲基亚砜(DMSO)100 μL，振荡器振荡10min使结晶物充分溶解后，酶标仪上测定各孔A490 nm值，计算细胞增殖抑制率(CPIR)， CPIR =(对照组A490 nm-实验组A490 nm)/对照组A490 nm×100%;并以A490 nm为纵坐标，时间(d)为横坐标绘制细胞生长曲线.

　　1.2.5流式细胞仪对BGC823细胞周期和凋亡率的检测取对照组和药物干预72 h后BGC823细胞，PBS洗涤2次，将细胞密度调整为1×109/L，700 mL/L预冷的乙醇-20℃固定24 h以上，加入Rnase A至终浓度为1 g/ L，37℃温育30 min，加PI至终浓度为50 mg/L，1 h内测定.

　　统计学处理: 实验数据以 x±s表示，应用SPSS13.0统计软件，对所得数据进行单因素方差分析， P<0.05为有统计学意义.

　　2　结果

　　2.1经5AzaCdR 处理前后BGC823 细胞RIZ1基因甲基化状态的变化未经5AzaCdR处理的BGC823细胞中RIZ1基因启动子区域显示高甲基化，为甲基化的纯合子，仅有甲基化产物;经3种浓度5AzaCdR分别处理后，则出现了杂合状态，甲基化和非甲基化引物均扩增出产物，说明甲基化和非甲基化的DNA序列均存在，表明RIZ1基因启动子区域高甲基化发生了逆转(图1).

　　2.2经5AzaCdR处理前后BGC823细胞中RIZ1 mRNA表达的变化未经5AzaCdR处理的BGC823细胞中未检测出RIZ1 mRNA的表达，3种不同5AzaCdR浓度处理组中均检测出RIZ1 mRNA表达，并随着浓度的增高其表达增强，浓度由小到大积分吸光度比值依次为0.509，0.716，0.831(图2).

　　2.35AzaCdR对BGC823细胞增殖活性的影响经3种不同浓度5AzaCdR作用后，BGC823细胞的生长增殖活性均有明显抑制，与对照组比较，细胞增殖速度出现不同程度减慢(图3). 对同一作用时间不同作用浓度5AzaCdR干预BGC823细胞后的细胞增殖抑制率进行比较，随着浓度的增加，细胞增殖抑制率显著增高(P<0.05).

　　2.45AzaCdR 对BGC823细胞周期和凋亡率的影响经3种不同浓度5AzaCdR作用72 h后，G0/G1期细胞明显增加，S细胞期明显减少，G0/G1期阻滞;细胞凋亡率显著增高(表1). 表15AzaCdR对BGC823细胞周期和凋亡的影响(略)

　　3讨论

　　DNA甲基化是一种发生在CpG二核苷酸上对胞嘧啶的共价修饰，是基因在转录水平的调控方式之一，它不存在DNA序列改变，是表型遗传学的一种[4]. RIZ1氮端含有PR domain，并含有8个锌指结构序列. PRdomain含有100多个氨基酸，介导蛋白蛋白相互作用，对染色体结构的稳定性起重要作用，可调控染色质的基因表达. 研究[2]表明，既有PRdomain 又有锌指结构的抑癌基因蛋白质分子具有控制细胞生长及抑制肿瘤发生的作用，RIZ1基因的表达可导致细胞生长阻滞并诱导细胞凋亡，从而发挥其抑癌基因的作用. 研究[3,5-6] 表明，RIZ1 mRNA在多种人类恶性肿瘤中的表达缺失或减少与其DNA启动子区域CpG岛高甲基化具有明显的关系，在肝癌、乳腺癌等中均检测到RIZ1基因启动子区域的高甲基化状态及RIZ1基因表达缺失.5AzaCdR是DNA甲基转移酶抑制剂中的一种，在临床上主要用于白血病等恶性血液病及肺癌的治疗，并取得了较好的疗效[7]. 我们的结果表明，未经5AzaCdR处理的BGC823细胞中RIZ1基因启动子区域显示为高甲基化状态，同时BGC823细胞中RIZ1 mRNA不表达;经5AzaCdR处理后，RIZ1基因的启动子区域高甲基化状态得到逆转，并可检出RIZ1 mRNA重新表达，并且RIZ1 mRNA的表达水平与药物作用浓度存在一定的正相关性.5AzaCdR干预BGC823细胞后，细胞增殖速度减慢，在一定范围内其抑制BGC823细胞增殖的作用呈量效关系，并使细胞生长停滞在G0/G1期，凋亡率显著升高. 由此证明， RIZ1 mRNA表达失活与其基因启动子区域CpG岛高甲基化高度相关，由于RIZ1基因启动子区域高甲基化而导致其表达失活，RIZ1基因的表达可通过5AzaCdR的去甲基化作用而被重新激活，使其转录活性得到恢复，从而使RIZ1基因再次发挥肿瘤抑制作用;另外也证明5AzaCdR对BGC823细胞有显著的抑制增殖和诱导凋亡的作用，并在一定程度上呈浓度依赖性，究其原因，5AzaCdR具有诱发因高甲基化而封闭的基因重获表达的去甲基化功能，通过逆转包括RIZ1基因在内的具有生长调控作用的基因启动子区域的高甲基化的状态，使这些基因重新获得表达，从而发挥抑制胃癌细胞生长及促进胃癌细胞凋亡的作用.

　　我们认为RIZ1基因在胃癌细胞中表达失活与该基因启动子区域CpG岛高甲基化高度相关，而5AzaCdR能够逆转其启动子区域高甲基化状态并恢复RIZ1基因的表达，使其再次发挥抑癌基因作用，为胃癌的早期诊断和临床治疗提供了一种新的依据. 对该领域的进一步探讨有利于阐明胃癌发生发展的分子机制，可能成为胃癌治疗新靶点.

　　【参考文献】

　　[1]Daskalakis M, Nguyen TT, Nguyen C, et al. Demethylation of a hypermethylated P15/INK4B gene in patients with myelodysplastic syndrome by5Aza2′deoxycytidine(decitabine)treatment[J]. Blood.2002,100(8):2957-2964.

　　[2]Buyse IM, Shao G, Huang S. The retinoblastoma protein binds to RIZ, a zincfinger protein that shares an epitope with the adenovirus E1A protein[J]. Proc Natl Acad Sci U S A，1995,92(10):4467-4471.

　　[3]Chang HW, Chan A, Kwong DL, et al. Detection of hypermethylated RIZ1 gene in primary tumor, mouth, and throat rinsing fluid, nasopharyngeal swab, and peripheral blood of nasopharyngeal carcinoma patient[J]. Clin Cancer Res，2003,9(3):1033-1038.

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　　[5]Du Y, Carling T, Fang W, et al. Hypermethylation in human cancers of the RIZ1 tumor suppressor gene, a member of a histone/protein methyltransferase superfamily[J]. Cancer Res，2001,61(22):8094-8099.

　　[6]钱波, 朱立新, 耿小平, 等. 肝细胞癌MGMT、DAPK、THBS1和RIZ1基因甲基化研究[J]. 中华普通外科杂志,2005,20(05):291-294.