Barrett食管组织中COX2和Bcl2的表达与癌变风险

　　作者：向明确,谢文义,袁晓英,王志宁,王旭东　　作者单位：重庆市第九人民医院消化科，重庆 400700

　　【摘要】目的研究COX2和Bcl2在Barrett食管(BE)相关病变组织中的表达意义. 方法： 胃镜下采用Lugol液染色，活检获得实验标本，HE染色观察病理特征. 用SP免疫组织化学方法检测正常食管上皮10例、中重度反流性食管炎23例、BE 45例和食管腺癌14例组织中COX2和Bcl2的表达，进行半定量分析，并预测BE的癌变风险. 结果： COX2在正常食管上皮、中重度反流性食管炎、BE、食管腺癌组织中的表达呈逐渐增强趋势. BE和食管腺癌组织中呈强阳性表达，表达率接近100%，且两种组织的表达强度无明显差异(P=0.334). Bcl2的表达变化与COX2基本一致. COX2在全周型的表达明显强于舌型和岛型两种形态的BE，但差异无统计学意义(P>0.05). LSBE黏膜中COX2的表达明显强于SSBE;重度肠化时COX2的表达显著强于无肠化和中低度肠化组织，差异有统计学意义(P<0.05). 低度、高度异型性增生的BE黏膜COX2均呈高表达，尤其在后者的组织中最强，两者间差异显著. LSBE，重度肠化生及高度异型增生BE组织中的表达与腺癌差异无统计学意义(P>0.05). 而腺癌与其余各类型BE的表达差异均有统计学意义(P<0.05). Bcl2在不同类型BE及腺癌组织中的表达差异与COX2基本一致. 结论： BE与腺癌中Bcl2与COX2的表达最强，不同程度肠化生时，Bcl2的表达变化无显著差异.

　　【关键词】 Barretts食管,环氧化物酶2,基因，Bcl2

　　0引言

　　Barrett食管(Barrett esophagus, BE)是重要的食管腺癌的癌前病变. BE的癌变率约为每年1/104人，较一般人群高30～125倍，80%的食管腺癌发生于BE，而40%的食管胃交界处腺癌与BE有关[1]，机制目前还不清楚. 环氧合酶2(cyclooxygenase2, COX2)是花生四烯酸转化为前列腺素的限速酶，可促进细胞恶变的进程，导致BE上皮过度增生甚至癌变. Bcl2是一种凋亡蛋白，常见的功能是抑制凋亡，引起细胞存活增加. COX2激活后，可通过前列腺素诱导其下游的Bcl2表达升高，增强抗凋亡作用. 我们采用免疫组织化学技术检测COX2和Bcl2在各类型BE、反流性食管炎、食管癌及正常食管组织中的表达变化情况，并结合临床实际，初步探讨二者表达变化的意义以及预测BE发生癌变风险高低的可能性.

　　1材料和方法

　　1.1材料根据200512重庆首届BE会议达成的诊治共识(草案)[2]，200403/200712胃镜活检或心胸外科手术获得符合要求的病理标本92(男56，女36)例，年龄19～72(平均48.2)岁. 分类：① 正常食管上皮组10例;② 中重度反流性食管炎组23例;③ BE组45例;④ 食管腺癌组14例. BE分型：舌型15例，岛型18例，全周型12例;长节段型BE(long segment Barrett esophagus，LSBE)8例，短节段型BE(short segment Barrett esophagus，SSBE)37例;无肠化13例，低/中度肠化24例，重度肠化8例;不伴异型性增生19 例，低度异型性增生21 例，高度异型性增生5例. COX2兔抗人mAb,Bcl2鼠抗人mAb,二抗(即用型第二代免疫组化ElivisionTMPlus广谱试剂盒)均购于福建迈新公司.

　　1.2方法胃镜下，采用Lugol液染色，钳取橘红色病变组织，甲醛中常温固定保存备用. 常规石蜡包埋、切片及HE染色;标本漂洗、脱蜡;30 mL/L H2O2阻断内源性过氧化物酶，微波抗原修复，非免疫血清封闭;分别滴加COX2和Bcl2一抗抗体(工作浓度1∶150)，4℃孵育过夜;滴加即用型第二代免疫组化ElivisionTM Plus广谱试剂盒试剂A，37℃孵育，然后滴加试剂B;DAB复合物显色，苏木素复染;室温干燥后，乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片. 阴性对照：以PBS代替一抗. 阳性对照：结肠癌组织. 细胞核膜或胞质内出现棕黄物质者为阳性细胞. 分别对每张切片的阳性细胞率和阳性细胞着色强度进行分级记分. 阳性细胞率：至少计数5个高倍视野的细胞, 计算阳性细胞比例. 0 分：阳性细胞≤5%;1 分：6%～30%;2 分：31%～70%;3 分：≥71%. 阳性细胞着色强度：0 分：阴性; 1 分：弱阳性;2 分：阳性;3 分：强阳性. 根据两项积分之和确定阳性程度，1～3 分为低表达，4～6 分为高表达.

　　统计学处理：应用SPSS11.0 统计软件, 采用等级分组秩和检验. P<0.05为差异有统计学意义.

　　2结果

　　2.1COX2和Bcl2在食管组织中的表达在表达的细胞阳性率和表达强度方面，COX2均明显强于Bcl2;两种因子均主要表达于上皮层细胞，基底层细胞及黏膜下层细胞也有较显著的表达;阳性物质主要分布于细胞质和核膜周围，呈弥漫型、局灶型、颗粒型或条型分布(图1A～D，图2). COX2：全周型的表达明显强于舌型和岛型两种形态的BE，但表达差异无统计学意义(P>0.05). SSBE黏膜中COX2的表达弱于LSBE，差异有统计学意义(P=0.018). 不同程度肠化生的BE黏膜中均有COX2高表达，重度肠化时COX2的表达显著强于无肠化和中低度肠化组织，三者间差异有统计学意义(P=0.035). 低度、高度异型性增生的BE黏膜COX2均呈高表达，尤其在后者的组织中最强. 两者间差异有统计学意义(P=0.044). Bcl2：全周型的表达强于舌型和岛型BE，但表达差异无统计学意义(P>0.05). LSBE黏膜中Bcl2的表达强于SSBE，差异有统计学意义(P=0.023). 不同程度肠化生的BE黏膜中均有Bcl2高表达，重度肠化时Bcl2的表达最强，三者间差异无统计学意义(P>0.05). 无异型性增生、低度、高度异型性增生的BE黏膜Bcl2均呈高表达，尤其在高度异型性增生中最强. 两者间差异有统计学意义(P=0.037，图1E～L,表1).

　　2.2COX2和Bcl2的表达差异两种因子在腺癌及BE组织中的表达均无明显差异. COX2：全周型、舌型和岛型与腺癌组织的表达差异均有统计学意义(P分别为0.043, 0.0001, 0.015). LSBE、重度肠化生及高度异型增生BE组织中的表达与腺癌无统计学差异(P值分别为0.667，0.33，0.557)，而SSBE、无肠化和中低度肠化组织、以及BE不伴或伴有低度异型性增生时的表达与腺癌组织相比，差异有统计学意义(P<0.05或0.01). 对于Bcl2则表现为：全周型BE与腺癌组织仍然有统计学意义上的差异(P=0.0391)，而LSBE、重度肠化生及高度异型增生BE组织中的表达与腺癌无统计学差异(P值分别为0.511，0.830，0.770，0.409);腺癌与其余各类型BE的表达差异也均有统计学意义(P<0.05或0.01).

　　A:COX2 BE; B:COX2腺癌; C: Bcl2 BE;D: Bcl2腺癌;E:COX2全周型BE; F: COX2 LSB;G:COX2重度肠化生BE; H:COX2高度异型性增生BE; I:Bcl2全周型BE; J:Bcl2 LSBE;K:Bcl2重度肠化生BE; L:Bcl2高度异型性增生. 表1COX2和Bcl2在不同类型BE组织中的表达

　　3讨论

　　癌变的发生与细胞增殖和凋亡的不平衡有关，如果细胞凋亡活跃，而增殖减少，可导致组织黏膜萎缩;如果细胞凋亡减少，而增殖活跃，增加了自发性DNA复制错误的产生几率，同时增加了内外致癌因子致DNA突变的机会，最终导致肿瘤的发生. COX2可以通过前列腺素影响细胞周期、细胞凋亡和细胞分化等多种途径以致促进肿瘤的形成[2-3]. 因此COX2在BE相关食管腺癌等多种恶性肿瘤的发生、发展和转归中扮演了一个及其重要的角色，但具体机制不确切. COX2属于肠分化的标志物之一，但在无肠上皮化生的BE组织中同样见到COX2的显著表达，提示这些柱状上皮细胞具有转化为杯状细胞的潜能，从而导致BE上皮过度增生或癌变. 另外，在食管腺癌发生早期与COX2密切相关;并推测，COX2参与的食管肿瘤形成的早期事件中，其表达发生在癌前的柱状上皮化生阶段，其基因的诱导是恶性表现型持续存在的必要条件，它可以促进Barrett上皮和腺癌细胞的增殖[4-6]. 本结果显示，COX2 和Bcl2在正常食管上皮、中重度反流性食管炎、BE、食管腺癌组织中的表达呈逐渐增强的趋势，但Bcl2弱于COX2. BE及相关性腺癌表达最强，中重度BE次之，正常组织有少量表达甚至不表达. 正常组织因存在轻微的炎症和生理性反流的刺激，故COX2有诱生性表达. 反流性食管炎中的较强表达提示，中重度BE可能为食管癌变提供了适宜的微环境，尤其是两种因子在BE、食管腺癌组织中呈强阳性表达，表达率为100%，且两种组织的表达强度无明显差异. 这说明虽然二者细胞有质的区别，但在某些生化特征方面已有共性. 由此，我们推测，由于COX2的高表达使得BE黏膜上皮细胞发生异型性增生、异常增殖，同时COX2激活其下游的Bcl2过度表达，Bcl2发挥抑制BE黏膜上皮细胞凋亡的作用，二者的联合作用使细胞的增殖与凋亡过程失衡，最终导致了BE癌变. 因此，COX2和Bcl2在BE中的同时高表达，预示了其加速向食管腺癌转变的进程. 所以此时的BE具有较高的癌变风险. 但是，事实上并不是所有的BE都会最终发生癌变，而组织癌变的机制又如此复杂且人类还远未探索明了，那么究竟什么状态BE的或者说什么阶段的BE最可能在近期演变成食管腺癌呢?

　　我们研究结果显示，COX2和Bcl2在全周型的BE中表达明显强于舌型和岛型两种形态的BE，但三者间的表达差异却无显著性;全周型、舌型和岛型与腺癌组织的表达差异有统计学意义. 从BE长度来看，LSBE黏膜中COX2的表达明显强于SSBE，差异有统计学意义，腺癌组织的表达与LSBE没有显著区别，而与SSBE组织的表达差异有显著性，且Bcl2表达变化是一致的. 这表明，LSBE黏膜细胞的某些特性更接近于腺癌细胞，所以LSBE发生食管腺癌的风险可能远高于SSBE. 从临床分析，LSBE的定义是指Barrett黏膜累及食管全周且SCJ到EGJ的距离大于3 cm，而且此时特殊肠上皮化生的程度也往往较重，发生溃疡、狭窄等并发症的几率也较高，治疗干预的效果也多较差，病程迁延，这样也使得LSBE发生食管腺癌的风险可能远高于SSBE. 从肠化生程度分析：重度肠化时COX2的表达显著强于无肠化和中低度肠化组织，三者间差异有统计学意义，而Bcl2的表达变化在三者间却没有统计学的差别. 这提示：BE伴不同程度肠化生时，细胞凋亡并不一定随肠化程度加重而增加. 当然这一结果也可能因实验误差所至，还有可能是实验标本数规模较小的原因. 当COX2和Bcl2均呈高表达时，伴有高度异型性增生的BE就具有极高的癌变危险，甚至可能已经癌变;而且对于有COX2和Bcl2较高表达的低度异型性增生的BE组织也同样具有较高癌变危险. 我们的研究结论与国内近期的相关研究结论是基本一致的[7].

　　综上所述，BE具有演变为食管腺癌的高风险. 在不同类型BE中，LSBE、重度肠化生及高度异型增生BE组织中COX2和Bcl2表达最高、最强，具有明显的癌变风险. Bcl2虽然不是癌症发生的原因，但由于其抑制细胞凋亡的作用，联合COX2的致细胞增殖作用，二者的相关性高表达同时发生时，则可能成为预测组织是否可能癌变的指标. 联合两种因子的表达变化，有可能成为一种预测BE是否将发生癌变的手段.

　　【参考文献】

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　　[5] Lagorce C,Paraf F,Vidaud D,et al.Cyclooxygenase2 is expressed frequently and early in Barretts oesophagus and associated adenocarcinoma[J]. Histopathology,2003,42(5):446-457.

　　[6] Fitzgerald RC.Barretts oesophagus and oesophageal adenocarcinoma how does acid interfere with cell proliferation and differentiation[J]. Gut,2005,54(Suppl 1):i21-26.

　　[7] 邹勍，黄石. Barrett食管和食管腺癌组织中Bcl2和p53蛋白表达及其相关性研究[J]. 内科急危重症杂志，2006，12(3)：128-130.