褪黑素对重症急性胰腺炎的保护作用

　　作者：王培培,吴建胜,高道键,方佩佩,贾国葆　　作者单位：温州医学院第一附属医院 消化内科，浙江 温州 325000

　　【摘要】 目的 探讨褪黑素(melatonin，MT)对重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)大鼠胰腺组织中 Smac/DIABLO、XIAP mRNA表达的影响及可能机制。方法 54只SD大鼠随机分成假手术(SO)组、重症急性胰腺炎(SAP)组以及MT干预SAP(MS)组，每组18只。通过胰胆管逆行注射3.5%脱氧胆酸钠方法制备大鼠SAP模型，MS组制造模型前30 min腹腔注射MT。收集各模型组3 h、6 h、12 h标本，观察胰腺组织，检测胰腺组织细胞凋亡，实时定量(real-time)PCR分析胰腺组织中Smac/DIABLO、XIAP mRNA的表达。结果 SAP组和MS组胰腺组织损伤较SO组严重。与SAP组相比，在3 h、6 h、12 h各时点MS组胰腺病理损伤明显减轻，细胞凋亡指数下降(P<0.05)，胰腺组织中Smac/DIABLO mRNA表达下调(P<0.05)，XIAP mRNA表达上调(P<0.05)。结论 MT能明显改善SAP胰腺组织损伤，对急性胰腺炎有保护作用;这可能与调节Smac/DIABLO、XIAP mRNA的表达有关。

　　【关键词】 褪黑素,急性胰腺炎,细胞凋亡,Smac/DIABLO;X-连锁凋亡抑制蛋白

　　Abstract Objective To investigate the effect of MT on the mRNA expression of Smac/DIABLO， XIAP in severe acute pancreatitis and its possible mechanism in rats. Methods Fifty-four SD rats were randomly divided into three groups： sham-operation (SO) group， SAP group and MT-pretreated (MS) group. SAP group were induced by retrograde injection of 3.5% sodium deoxycholate into the pancreatic duct. MS group were given intraperitoneal injection with MT 30 min before the induction of SAP. The specimens at 3 h， 6 h， 12 h were collected， the pathological changes of the pancreas were observed， the apoptosis of pancreas were detected and the mRNA expression of Smac/DIABLO and XIAP were analyzed by real-time PCR in pancreas. Results Compared with the SO group， the pancreas pathological changes in SAP group and MS group were significantly aggravated. Compared with SAP group， the pathology injury of pancreas in MS group was obviously alleviated， apoptotic index were markedly decreased (P<0.05)， the mRNA expression of Smac/DIABLO were greatly down-regulated (P<0.05) and the mRNA expression of XIAP were significantly up-regulated (P<0.05). Conclusion MT can improve the apoptosis of pancreas and alleviate the pancreas injury. The protective effect may be relate to the mRNA expression of smac/DIABLO， XIAP in acute pancreatitis.

　　Key words melatonin; acute pancreatitis; cell apoptosis; Smac/DIABLO; X-linked inhibitor of apoptosis protein

　　褪黑素(melatonin，MT)是松果体分泌的神经内分泌激素，通过MT受体、细胞因子等发挥抗氧化、抗炎、抗凋亡以及基因调节作用。大多数研究认为，褪黑素在急性胰腺炎中的保护作用是通过它的抗氧化，清除自由基等发挥作用，而对褪黑素通过调控凋亡通路来发挥抗凋亡、保护胰腺腺泡细胞的作用的研究甚少。X-连锁凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP)可通过抑制半胱天冬蛋白酶-3、-7及-9(caspase-3、-7、-9，)发挥抗凋亡作用，其作用受到多种相关因子的负性调控。第二个线粒体源的半胱天冬蛋白酶激活物/直接与凋亡抑制蛋白结合的低等电点蛋白(second mitochondrial activator of caspase/direct IAP binding protein with low PI，Smac/DIABLO)是多种负性调控蛋白的一种，通过与XIAP的结合，拮抗XIAP对caspase的抑制，发挥促凋亡作用。本实验旨在脱氧胆酸钠诱导的大鼠重症急性胰腺炎模型中，观察应用MT干预后胰腺组织细胞凋亡、病理组织改变及Smac/DIABLO、XIAP mRNA的表达，探讨MT在急性胰腺炎保护作用中的可能机制。

　　1 材料和方法

　　1.1 动物分组 健康SD雄性大鼠54只，体质量200~250 g，由温州医学院实验动物中心提供。将大鼠随机分成3组：假手术组(SO)、重症急性胰腺炎(SAP)组和褪黑素干预SAP组(MS)，每组各18只。

　　1.2 实验材料 紫外分光光度仪;实时定量PCR仪(ABI);褪黑素(Ruibio)：先用无水乙醇溶解，再加0.9%氯化钠注射液稀释，使乙醇浓度小于2%;脱氧胆酸钠(Sigma);Trizol(Invitrogen);First strand cDNA synthesis kit(MBI);SYBR Green PCR Master Mix(ABI);TUNEL试剂盒(Roche)。

　　1.3 动物模型制备 SD大鼠饲养1周后随机分组，术前12 h禁食不禁水，水合氯醛(5%，1.4 mL/200 g)腹腔内注射麻醉，无菌条件下经大鼠腹正中线入腹，确认胰管，采用20号静脉留置针经对侧的十二指肠插入肠腔，留置针进入十二指肠乳头后拔出内芯，同时在胆管出肝门处用无损伤小动脉夹夹闭，防止注入药物反流入肝脏。SO组仅翻动胰腺几次，SAP组匀速注入3.5%脱氧胆酸钠(0.1 mL/100 g)，MS组在诱导SAP前30 min经腹腔注射MT(50 mg/kg)，常规关腹，动物造模后于背部皮下分点注射2.0 mL无菌生理盐水，补充水分。各组大鼠分别于术后第3、第6、第12 h(各组各时间点6只)经下腔静脉取血5~8 mL，离心、留取上清液，于-20℃保存。并迅速取出胰腺组织平均分成两部分：一部分置于去RNA酶冻存管中，于-80℃保存;一部分经4%的多聚甲醛固定。心脏穿刺取血处死大鼠。SAP组大鼠在造模后6~12 h之间，死亡2只。MT组大鼠在6~12 h之间死亡1只，SO组大鼠全部成活。

　　1.4 胰腺组织病理形态学观察 胰腺组织常规脱水，石蜡包埋，切片，HE染色，光镜下观察胰腺组织病理改变。

　　1.5 胰腺组织细胞凋亡检测 脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL法)(按罗氏说明书进行)。石蜡组织切片(多聚赖氨酸处理过的玻片摊片)常规脱蜡，梯度水化，蛋白酶K消化，加TUNEL反应液，碱性磷酸酶抗体，DAB显色，苏木精复染，封片，观察。凋亡的腺泡细胞核内染色体发生断裂而被染成棕黄色，计算5个视野，每个视野中阳性细胞数/总细胞数×100%，即为凋亡指数(apoptosis index，AI)。

　　1.6 胰腺组织中Smac/DIABLO、XIAP mRNA表达

　　采用Trizol法提取总RNA，参照RT-PCR试剂盒(MBI)的说明反转录成cDNA，PCR引物由大连TaKaRa公司设计。引物序列：①GAPDH：上游引物GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG;下游引物ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA，②Smac/DIABLO：上游引物GACACTGTGCGCCGTTCCTA;下游引物GAGGTGCTGTCCGTTACCAAAGA，③XIAP：上游引物TGAGGTTCTGATTGCAGATCTTGTG;下游引物CTTGTAGGCGCCTTAGCTGCTC。循环设置：95℃ 10 min变性;95℃ 30 s;60℃ 30 s;72℃ 45 s;循环40次。反应完成后，得到所有标本的曲线，软件自动进行数据分析，调整基线，计算出 Threshold Cycle(Ct值)。每个标本均做3次重复，取其均数。反应完成后再于95℃ 15 s;60℃ 1 min;95℃ 15 s;得融解曲线。

　　1.7 Smac/DIABLO、XIAP mRNA计量方法 根据Livak和schmittgen[1]设计的阈值法测定目的基因的相对表达，目的基因量=2-△△Ct(△△Ct=(Ct目的基因-Ct管家基因)实验组-(Ct目的基因-Ct管家基因)对照组)。将所有样本组织管家基因GAPDH、Smac/DIABLO以及XIAP的Ct值带入公式计算得出各样本组织中Smac/DIABLO、XIAP mRNA相对表达量。

　　1.8 统计学方法 所有数据以x±s表示，进行正态性检验和方差齐性分析，采用t检验、完全随机设计单因素方差分析、SNK-q检验。

　　2 结果

　　2.1 胰腺组织学改变 显微镜下，SO组各时间点胰腺组织小叶清晰，未见明显异常;SAP组3 h胰腺间质水肿，伴少量炎细胞浸润;6 h后胰腺间质水肿，出血，炎细胞浸润明显增加;12 h严重出血，见中性粒细胞和单核细胞浸润。MS组各时点与SAP组相应时点比较，胰腺组织病理损伤均明显减轻。

　　2.2 胰腺组织细胞凋亡情况　 SO组细胞凋亡指数各时点之间差异无统计学意义(P>0.05);SAP组细胞凋亡指数各时点均较SO组相应时点增加，各时点差异有统计学意义(P<0.05);MT组各时点细胞凋亡均较SAP组相应时点降低，差异有统计学意义(P<0.05)。(表1，图1)

　　2.3 大鼠胰腺组织Smac/DIABLO、XIAP mRNA的表达 管家基因GAPDH、Smac/DIABLO以及XIAP分别在18-21、25-28、27-31循环时进入指数扩增期。

　　Smac/DIABLO mRNA的表达 MS组与SAP组表达水平以SO组为参照。Smac/DIABLO mRNA表达在SAP组各时点随时间延长而减少，差异有统计学意义(P<0.05)，MS组各时点均较SAP组相应时点降低，差异有统计学意义(P<0.05)(见图2)。

　　XIAP mRNA的表达 MS组与SAP组表达水平以SO组为参照。XIAP mRNA 表达在SAP组各时点随时间延长而增多，差异有统计学意义(P<0.05)，MS组各时点均较SAP组相应时点增多，差异有统计学意义(P<0.05)(见图3)。

　　3 讨论

　　MT为一种小分子的脂溶性物质，是现知最强的抗氧化剂，其易通过解剖生理屏障进入亚细胞，可在细胞膜、细胞浆及细胞核中发挥作用，在急性胰腺炎中的研究受到广泛的关注。MT可通过MT受体、细胞因子等发挥抗凋亡作用，其抗凋亡的机制包括调节死亡受体途径和线粒体途径中多种分子的表达等，它的这些作用可能与它的线粒体生理学有关[2]。

　　本实验应用MT 50 mg/kg在制造大鼠SAP模型前30 min预处理SAP大鼠，随着时间延长MS组较SAP组相应时间点胰腺组织病理损伤减轻，表明MT预处理SAP可改善胰腺组织损伤，对SAP具有保护作用。

　　有研究表明，MT通过线粒体途径调节细胞凋亡，Han YX等[3]等在神经元缺血再灌注损伤中研究结果表明，MT能减少DNA损伤，抑制线粒体释放细胞色素C和凋亡蛋白酶caspase-3的激活，阻止缺氧缺糖(oxygen-glucose deprivation，OGD)缺失引起的线粒体膜电位改变，说明在缺血再灌注中MT通过线粒体途径调节凋亡。Gülben K[4]等研究MT在急性胰腺炎中的作用时指出，其可能通过降低血清TNF-a水平对急性胰腺炎起保护作用。

　　XIAP是凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein，IAP)家族中结构最典型、功能最强的一种，通过抑制caspase-3、-7、-9发挥抗凋亡作用，其作用受到多种相关因子的负性调控。Smac/DIABLO是一种促凋亡蛋白，是目前发现的唯一直接抑制XIAP的负性调节因子。它既参与凋亡的线粒体途径又参与死亡受体途径[5]。Smac/DIABLO可以特异结合XIAP，解除XIAP对于caspase-3、caspase-9等的活性抑制作用，从而促进凋亡[6]。但细胞凋亡是众多信号分子、效应分子互相影响互相作用的结果。

　　本实验通过实时定量PCR的方法检测模板Smac/DIABLO、XIAP mRNA的相对表达。在SAP中，可能通过高表达XIAP抑制caspase的激活，抑制细胞凋亡。MT干预SAP后各时点Smac/DIABLO mRNA表达下调、XIAP mRNA表达上调，说明MT保护急性胰腺炎的机制可能是通过细胞凋亡途径起作用。但是MT也可以通过清除氧自由基、增强抗氧化酶作用、调节细胞因子、褪黑素受体、中枢神经系统、增加胰腺血流量、改善胰腺微循环等对急性胰腺炎起保护作用[7]。何种机制起主要作用，尚没有明确的结论，有待进一步的研究。

　　【参考文献】

　　[1] Livak KJ， Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T))method[J]. Methods，2001，25(4)：402-408.

　　[2] Acuna-Castroviejo D， Escames G， Rodriguez MI， et al. Melatonin role in the mitochondrial function[J]. Front Biosci，2007， 12：947-963.

　　[3] Han YX， Zhang SH， Wang XM， et al. Inhibition of mitochondria responsible for the anti-apoptotic effects of melatonin during ischemia-reperfusion[J]. J Zhejiang Univ Sci B，2006，7(2)：142-147.

　　[4] Gülben K， ?魻zdemir H， Berberolu U， et al. Melatonin modulates the severity of taurocholate-induced acute pancreatitis in the rat[J]. Dig Dis Sci，2010，55(4)：941-946.

　　[5] Verhagen AM， Coulson EJ， Vaux DL. Inhibitor of apoptosis proteins and their relatives： IAPs and other BIRPs[J]. Genome Biol，2001，2(7)：reviews3009.

　　[6] Kominsky DJ， Bickel RJ， Tyler KL. Reovirus-induced apoptosis requires mitochondrial release of Smac/DIABLO and involves reduction of cellular inhibitor of apoptosis protein levels[J]. J Virol，2002，76(22)：11414-24.

　　[7] 吴爱荣，许春舫. 褪黑素干预急性胰腺炎的实验研究进展[J]. 国际消化病杂志，2007，3(27)：197-199.