红景天苷对糖尿病模型大鼠海马CA1区ChAT和BDNF阳性神经元的影响

糖尿病神经系统病变是糖尿病重要的合并症之一，轻者出现认知功能障碍，严重者出现痴呆，严重地影响老年患者的生活质量。目前尚缺少特效治疗药物及方法。红景天苷是红景天的主要活性成分，其在抗衰老、调节新陈代谢、双向调节血糖、抗疲劳、提高中枢兴奋性、抗辐射等方面有显著疗效，近年来国内外的医学工作者对红景天进行的深入研究表明，红景天苷具有促进PC12细胞分化和抑制细胞凋亡的作用。目前为止，尚无实验证据证实红景天苷对糖尿病大鼠学习功能及记忆功能的改善作用。本研究通过构建Wistar大鼠糖尿病模型，利用水迷宫试验及免疫组化法考察红景天对糖尿病模型大鼠海马CA1区ChAT和BDNF阳性神经元的影响，从而为红景天的临床应用提供依据。

1材料与方法

实验材料实验动物：吉林大学实验动物中心提供的健康雄性Wistar大鼠 (12周龄，体重200～250 g)。实验药品：红景天苷为红景天根茎提取物，红景天系景天科红景天属植物，提供自吉林东丰药业股份有限公司;链脲佐菌素(STZ)为Amresco公司产品。实验仪器及试剂： ACCU-CHEK血糖仪(德国罗氏)、Morris水迷宫自动监控仪(中国医学科学院药物研究所)、LS-3000+冰冻切片机(沈阳龙首电子仪器)、TGL20M型低温高速离心机(湖南湘立科学仪器有限公司)、UV-3200S型紫外可见分光光度计(南京途威贸易有限公司)、YS100型显微镜(日本Nikon)。实验方法试验样品制备：取红景天根茎100 g，粉碎后在1 000 ml的70%乙醇中浸泡72 h，浸液经减压回流提取2 次，每次40～60 min，经过过滤后，浸液浓缩至无醇味，加入适量的水控溶，之后所得水溶液用正丁醇将其萃取，挥发所得溶液最后制得干粉2.5 g。动物模型构建：适应性喂养2周实验大鼠，挑取合格大鼠并将其禁食24 h，每只大鼠进行单次腹腔注射STZ(60 mg/kg，溶于pH 4.2，0.1 mol/L枸橼酸钠缓冲液)，并于3 d后检测实验大鼠的尾静脉血上的血糖浓度。实验大鼠模型以血糖浓度大于16.67 mmol/L为指标以确定是否真正建模成功。正常实验大鼠对照组(CON)的10只大鼠仅腹腔注射等容积的缓冲液。水迷宫试验：morris水迷宫实验的基础是大鼠在水中有强烈的逃避水环境的动机，并以最快、最直接的途径逃离水环境。该试验在中国医学科学院药物研究所完成。水迷宫实验设备包括一个黑色圆形水池高、一个平台、一台跟踪摄像机以及摄像机相联的计算机。池内盛水深约50 cm，水温约为22℃~24℃。平台置于水面下2 cm。在水中加入牛奶将水搅浑以免让动物看清水下平台。摄像机位于水池中央上方200 cm，记录大鼠的位置、游泳距离和时间以及游泳路径等。房间周围墙壁上贴有色彩鲜明、形状不同的图画做为迷宫外暗示。该试验周期为4 d，将水池分为4个象限，平台置于其中一个象限区的中央。 将大鼠头朝池壁放入水中，放入位置随机取东、西、南、北四个起始位置之一。记录动物找到水下平台的时间，该时间即为逃避潜伏期时间。石蜡切片免疫组化试验：采用SP法将石蜡切片逐级脱腊至水，磷酸缓冲液冲洗5 min，该实验过程重复进行3次。组织切片抗原热修复步骤：枸橼酸盐修复液，95℃~98℃，持续5~10 min，待冷却至室温，磷酸缓冲液冲洗5 min，反复进行3次。免疫组化染色步骤如下：3%过氧化氢室温阻断15 min;磷酸缓冲液冲洗5 min，反复进行3 次;5%正常山羊血清封闭，室温孵育30 min;倾去血清，滴加(1〖DK〗∶100)稀释的一抗，4℃过夜;磷酸缓冲液冲洗5 min，反复进行3次。滴加生物素化的二抗50 μl，室温孵育 20 min;磷酸缓冲液冲洗5 min，反复进行三次;滴加辣根酶标记的链酶卵蛋白50 μl ，室温孵育20 min;磷酸缓冲液冲洗5 min，反复进行3次;DAB试剂显色操作，在显微镜下进行观察;蒸馏水反复充分进行冲洗，Mayer苏木素复染(避免过染)，弱氨水返蓝，梯度乙醇脱水，待脱水彻底后进行二甲苯透明，最后中性树胶封片。显微计数：所有标本在10×40倍光学显微镜下进行观测，并在10×10方格参照体积内计数阳性染色细胞截面与方格横线的交点数，各切面在海马CA1区随机计数3个视野并取其均值，依据截点/总线长法，计数各切面ChAT和BDNF阳性神经元面积的密度值。图像分析及统计学分析：每组实验模型大鼠的每张切片取5个视野，其中阳性细胞数利用CT2-BI-2000医学图像分析系统，对各组实验模型大鼠的海马CA1区的ChAT及BDNF进行计数，每只动物的每个指标为5张切片的平均值，其中阳性细胞含量以ChAT及BDNF阳性细胞百分率表示，阳性细胞百分率=阳性细胞数/总细胞数×100%，实验数据以均数±标准差(x〖TX-*3〗±s)表示。应用SPSS11 .0统计软件处理，采用方差分析，t检验。

2结果

试验中将Wistar大鼠分为三组，每组10只，随机分为正常对照组(CON组)、糖尿病组(DM组) 及红景天苷组(DM+S组)。DM组及DM+S组分别给予链脲佐菌素(STZ)腹腔注射，制备糖尿病模型。DM+S组给予红景天苷50 mg/kg灌胃治疗。用药12 w后，监测大鼠血糖和体质量变化，从而考察红景天苷对各组大鼠海马CA1区ChAT阳性神经元的影响。结果如表1，红景天苷组实验模型大鼠海马CA1区ChAT和BDNF阳性神经元的测量数值高于糖尿病组实验模型大鼠。红景天苷对各组大鼠海马CA1区ChAT阳性神经元的影响。见表1。本研究提示，学习与记忆功能与海马及大脑新皮质的组织结构密切相关。学习记忆相关脑区海马神经元，其可涉及学习记忆过程，它的损伤、丢失可能是学习记忆损害的部分原因，CA1区神经元的丢失与学习记忆损害关系更为密切。基底前脑的神经元是大脑皮质胆碱能神经支配的主要来源，其发出的突起投射到海马、扣带皮质和半球对侧面，包括额叶、顶叶、和颞叶等。各组大鼠海马CA1区BDNF和 Ch AT阳性神经元

3讨论

乙酰胆碱(ACh)为中枢及周边神经系统中常见的神经传导物质，研究表明学习与记忆功能与脑内乙酰胆碱的含量相关[1]，ACh由乙酰胆碱酯酶在适宜的环境下催化分解，同时由ChAT催化合成，并通过与乙酰胆碱受体结合而发挥其生物学效应，其在生物神经传导中其关键作用。ACh的动态平衡反应依靠ChAT与AChE的协调作用。近年来的研究表明，对糖尿病认知障碍患者的观察中发现脑中ChAT活性下降，且与认知障碍程度呈正相关。脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)是1982年首先在猪脑中发现的一种具有神经营养作用的蛋白质,其是在脑内合成的一种蛋白质，为NFT家族成员之一，BDNF及其受体主要是在中枢神经系统内表达,其中海马和皮质的含量最高。其对神经元细胞的增殖和分化具有促进作用，同时中枢及外周神经元存活和轴突生长具有明显调节作用，从而对周围神经和中枢神经元的存活、分化、生长起着关键的作用[2]。有相关实验研究推测BDNF可能通过抑制CaMKn以及MAP-kinase活性，影响囊泡和神经递质的释放，进而影响学习与记忆能力，与本实验的观点基本一致， BDNF的特殊作用表现在可以提高基底前脑胆碱能神经元ACh的释放及隔核、增强海马ChAT活性，增加隔核内胆碱能神经元的数目。因而BDNF 的缺乏可导致学习、记忆能力障碍[2]。大量研究表明BDNF分布在中枢神经系统、周围神经系统、内分泌系统、骨和软骨组织等广泛区域内,在成体动物的大脑皮质、海马、基底节、小脑及脑干等组织中均有表达，其可能在中枢神经系统中起重要保护作用。另外的大量研究表明，在健康大鼠的BDNF基因敲除实验中，大鼠的学习能力及记忆能力大大降低，从而充分说明了BDNF可能参与了空间学习及记忆过程。老年糖尿病患者认知功能障碍是多种因素参与的复杂病理过程。本研究结果发现，糖尿病大鼠海马CA1区ChAT和BDNF阳性神经元的数量明显减少，细胞形态出现退行性改变，核膜不清，高尔基体、粗面内质网数量减少，核糖核蛋白体脱粒增多，部分线粒体膜和嵴模糊或消失。说明，长期糖尿病的高血糖状态造成学习记忆相关脑区--海马神经元细胞出现变性、坏死、凋亡等病理学改变，从而发生了糖尿病性学习记忆障碍。应用红景天苷后，糖尿病实验模型组大鼠的海马CA1区ChAT和BDNF阳性率的提升明显，同时红景天苷组实验模型大鼠海马神经元细胞形态较为正常，细胞器丰富，线粒体较为完整等。由此可见，红景天苷是红景天主要药理活性成分，具有抗氧化、抗疲劳、调节新陈代谢、调节神经系统和内分泌系统、调节血糖等功效。在各医院临床科室的实际应用中具有许多潜在的价值，有待进一步发掘与利用。在体外实验研究显示[3-4]，红景天苷可提高SOD活性，清除自由基，发挥其抗氧化的[4]，本研究发现红景天苷在STZ诱导糖尿病模型大鼠中具有一定的提高实验模型大鼠海马CA1区ChAT和BDNF阳性神经元的表达，从而改善糖尿病模型大鼠的学习记忆功能。

4 参考文献

[1] Pepeu G,Giovennini MG.Changes in acetylcholine extracellular levels during cogn itive processes[J].Learning ang Memory,2004,11(1)21

[2]吴伟，王虔，梁浩，等.重组腺病毒载体转导的脑源性神经营养因子在大鼠体外培养海马神经元谷氨酸损伤模型中的保护作用[J].中华神经科杂志，2003，38(7):457

[3]张〓术，曾智发,储智勇，等.复方红景天制剂对记忆损伤小鼠的改善及作用及机制[J].中华行为医学及脑科学杂志,2012;21(9):797

[4]陈燕清，李丽，杨发明，等.红景天对血管性痴呆大鼠空间学习记忆能力及海马组织SOD ，MDA影响的实验研究[J].山西中医学院学报，2008,2:22 [收稿日期：2014-01-10 编校：李晓飞]