雷公藤内酯醇抑制胰腺癌细胞增殖和诱导凋亡的研究
发表时间：2011-11-04 浏览次数：425次
作者：曹维**,丁晓凌,张海峰,吴深宝 作者单位：南通大学附属医院消化内科， 南通
【摘要】目的：探讨雷公藤内酯醇(TL)对胰腺癌细胞增殖和凋亡的影响及其机制。方法：胰腺癌细胞SW1990与TL共同孵育，采用MTT法观察TL对胰腺癌细胞增殖的抑制作用，以流式细胞仪AnnexinⅤ/碘化丙啶(PI)双染法检测TL对SW1990细胞的凋亡的诱导作用和对细胞周期的干预作用。结果：TL抑制SW1990细胞增殖和促进细胞凋亡，呈现为浓度和时间依赖性，TL阻滞胰腺癌细胞周期于G0/G1期。结论：TL能抑制胰腺癌细胞增殖、诱导细胞凋亡及干预胰腺癌细胞周期，TL具有潜在的肿瘤治疗作用。
【关键词】 胰腺肿瘤;雷公藤内酯醇;细胞凋亡
[Abstract] Objective: To investigate the effects and the possible mechanism of triptolide on the growth and apoptosis of human pancreatic cancer cell in vitro. Methods: The pancreatic cancer cell line SW1990 was treated with triptolide. MTT method was used to determine the inhibitory effect of triptolide on cell proliferation, and flow cytometry (FCM) with AnnexinⅤ-FITC and propidium iodide (PI) staining was used to determine apoptosis induction and blocking effects of triptolide on the cycle proliferation. Results: After the treatment with triptolide, cell proliferation was blocked by triptolide, which showed a significant positive association with the level of triptolide concentration(P<0.01), and the apoptotic rates of SW1990 cells were increased in concentration-dependent and time-dependent manners, and its cell cycle was arrested at G0/G1 phase. Conclusion: Triptolide is able to inhibit proliferation , induce the apoptosis and block cell cycle effect on pancreatic cancer cells. The potential for its treatment is worth further investigating.
[Key words] Pancreatic neoplasm;Triptolide;Apoptosis
雷公藤内酯醇(triptolide，TL)是一种从雷公藤等中分离得到的二萜内酯化合物，有明确的抗炎和免疫抑制作用，新近研究发现它有很强的抗肿瘤活性，并能增强多种细胞毒药物的疗效，TL的水溶性前体物PG490-88，正在前列腺癌患者中进行一期临床试验，具有广阔的应用前景[1]。本研究观察了TL对胰腺癌细胞SW1990增殖和凋亡的影响以及对胰腺癌细胞周期的阻滞作用，探讨TL作为胰腺癌的化学治疗药物的可能性。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 细胞培养
胰腺癌细胞SW1990由上海交通大学附属第一人民医院消化内科王兴鹏教授惠赠。细胞以含有10%小牛血清的DMEM培养基(Gibco)于37 ℃恒温、5%CO2培养箱中培养，培养基中另加入100 U/ml青霉素、0.1 mg/ml链霉素，2～3 d传代1次。
1.1.2 试剂及器材
TL由中国协和医科大学皮肤病研究所药物研究室马鹏程教授惠赠。二甲亚砜(DMSO)(上海晶美生物公司)。流式细胞仪(FACScalibur型)(美国BD公司)。激光共聚焦扫描显微镜(德国Leica公司)。酶标仪(ELX800通用型)(美国BIO-TEK公司)。Annexin V/PI 试剂盒(英国BioVision公司)。
1.2 方法
1.2.1 TL药液配制及给药处理
TL粉剂1 mg，DMSO 100 μl助溶，磷酸缓冲液(PBS)按10倍稀释，配成药物原液，室温保存。应用时加DMEM培养基稀释成所要求的药液浓度。
1.2.2 TL对细胞毒性作用的形态学观察
药液浓度10-1 μg/ml的TL孵育SW1990细胞，倒置显微镜分别观察24、48、72 h的细胞形态变化。
1.2.3 TL对细胞生长的抑制作用
指数生长期的SW1990细胞以4×103个/孔传入96孔培养板，孵育24 h后，每孔加入不同药液浓度(101～10-5 μg/ml)的TL 100 μl，所含溶媒DMSO最高终体积分数为0.1% (该浓度对细胞无明显损害)，对照组加入等量培养基和溶媒DMSO(0.1%)。分别于加药后24、48、72 h检测细胞活力。细胞孵育终止前，每孔加入5 mg/ml MTT 20 μl，4 h后弃上清液，用100 μl 0.4 mmol/L酸化异丙醇溶解结晶，用酶标仪测定每孔的A值，以A值代表细胞生长的程度(A=λ570)，计算各种药物浓度和不同时间的TL对细胞的抑制率。
1.2.4 流式细胞仪检测细胞凋亡细胞和细胞周期的改变
收集的细胞(TL 10-1 μg/ml孵育24 h的细胞和对照组)用70%预冷的酒精固定，置于-20 ℃条件下过夜。细胞悬液再用0.01 mmol/L PBS洗2次，调整细胞浓度为1×107个/ml，取200 μl细胞，加入RNA酶(0.1%)100 μl，37 ℃孵育30 min，加入PI染液至终浓度为50 μg/ml。用尼龙网过滤后20 min后上流式细胞仪检测。AnnexinⅤ/PI双染法检测凋亡细胞程度。 根据公式计算细胞增殖指数(PI)。细胞增殖指数(PI/%)=( S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M)×100%。
2 结 果
2.1 TL对胰腺癌细胞形态的影响
胰腺癌细胞SW1990经TL作用后发生明显形态改变，随着时间推移，变化越明显。10-1 μg/ml药液浓度的TL与SW1990细胞孵育:24 h后细胞生长较密，且多数细胞形态饱满，少部分细胞变圆、变小，少许细胞脱落;48 h后细胞生长较稀疏，细胞形态变小，脱落细胞明显增多;72 h后大多数细胞脱落、漂浮。
2.2 TL对胰腺癌细胞增殖的影响
取不同浓度TL对SW1990细胞进行增殖抑制试验寻找最佳给药浓度，培养6、12、24 h后，TL均对SW1990细胞表现出抑制作用，起效质量浓度分别为1 μg/ml、10-1 μg/ml和10-2 μg/ml(P<0.01)。且随着药物质量浓度的提高，对SW1990细胞增殖抑制作用相应增加，1 μg/ml、10-1 μg/ml和10-2 μg/ml各药物浓度组比较差异不明显(P>0.05)。我们选择10-1 μg/ml作为半有效量(ID50)作为实验用量。
2.3 TL对胰腺癌细胞凋亡和细胞周期的影响
随着TL药液浓度的增高，SW1990细胞凋亡指数增高，以10-1 μg/ml TL作用于SW1990胰腺癌细胞，观察不同时间(0、6、12、18和24 h)的诱导凋亡效果，与用药组相比较，凋亡的胰腺癌细胞数目明显增多，随着作用时间的延长细胞凋亡率逐渐升高，从6 h始，TL处理组凋亡率显著高于对照组，24 h凋亡率达38.50%，而对照组则仅为14.97%(图1、2，见封二)。TL(10-1 μg/ml)与SW1990细胞孵育24 h后，G0/G1期细胞占(69.57±0.34)%，G2/M期占(9.74±1.22)%，S期细胞为(20.69±1.09)%。对照组细胞， G0/G1期为(45.74±0.82)%， G2/M期为(17.51±5.41)%， S期为(36.80±6.95)%。与对照组相比较，药物干预组G0/G1期细胞显著高于对照组(P<0.01)，而G2/M期细胞和S期细胞低于对照组(P<0.05)(图3、4，见封二)。药物作用组的PI为(29.43±0.33)%，显著低于对照组(54.26±0.89)%(P<0.01)。
3 讨 论
雷公藤内酯醇，又称雷公藤内酯、雷公藤甲素，是从卫矛科雷公藤属雷公藤、昆明山海棠以及苍山雷公藤、东北雷公藤等物质中分离得到的二萜内酯化合物。TL的生理活性强，具有显著的抗炎、抗肿瘤、抗生育及免疫调节作用，在临床上得到了广泛的应用。目前已有许多文献报道了TL具有抗肿瘤细胞增殖和诱导凋亡作用[2-3]，我们初期的研究也表明TL对胰腺癌细胞具有抑制增殖作用[4]。本实验结果表明，TL抑制胰腺癌细胞增殖，随着TL药液浓度的增高，作用越强。高小平等[5]研究发现TL具有很强的抗肿瘤活性，其作用明显强于紫杉醇，对5种组织的恶性肿瘤细胞生长均有显著的抑制作用，对某些肿瘤细胞如卵巢癌和肾癌细胞等作用尤其明显。
本研究采用AnnexinⅤ/PI双染法检测显示TL诱导SW1990细胞凋亡的程度。由于， AnnexinⅤ/PI双染法能够区分凋亡细胞和坏死细胞，从而更准确地对凋亡细胞进行定量。流式细胞术(FCM)检测显示TL诱导SW1990细胞凋亡， 呈现出一定的浓度依赖性和时间依赖性。MTT法和FCM法均提示10-1 μg/ml是TL抑制胰腺癌细胞SW1990增殖和诱导凋亡的最佳有效浓度。Chan等[6]报道TL诱导人HL60、Jurkt和SMMC-7721细胞凋亡，其IC50分别为7.5 nM、27.5 nM和32 nM。
进一步观察发现，TL还具有干预细胞周期的作用。我们进行细胞周期分析发现，TL可使S期细胞和G2/M期细胞减少，G0/G1细胞增多，说明TL使细胞DNA合成抑制，产生G1期阻滞，细胞周期进程减缓。Jiang等[7]亦发现TL使G0/G1期细胞增多，产生细胞生长抑制，和我们的研究一致。而有研究发现TL不依赖P53途径，通过阻断p21WAF1/CIP1介导的细胞生长抑制作用，G2/M期、S期细胞增多，从而产生不一致的细胞周期检查点而促进肿瘤细胞凋亡[8-9]。其不一致具体原因有待进一步研究。
【参考文献】
[1] Kiviharju TM, Lecane PS, Sellers RG, et al. Antiproliferative and proapoptotic activities of triptolide(PG490), a natural product entering clinical trials, on primary cultures of human prostatic epithelial cells[J]. Clin Cancer Res, 2002, 8(8):2666-2674.
[2] Shu B, Duan W, Yao J, et al. Caspase 3 is involved in the apoptosis induced by triptolide in HK-2 cells[J]. Toxicol In Vitro, 2009, 23(4):598-602.
[3] Borja Cacho D, Yokoyama Y, Chugh RK, et al. TRAIL and triptolide:an effective combination that induces apoptosis in pancreatic cancer cells[J]. J Gastrointest Surg, 2010, 14(2):252-260.
[4] Zhou GX, Ding XL, Huang JF, et al. Apoptosis of human pancreatic cancer cells induced by Triptolide[J]. World J Gastroenterol, 2008, 14(10):1504-1509.
[5] 高小平, 李伯刚, 周建, 等. 雷公藤内酯醇体外抗肿瘤作用和诱导细胞凋亡的研究[J]. 天然产物研究与开发, 1999, 12(1)：18-21.
[6] Chan EW, Cheng SC, Sin FW, et al. Triptolide induced cytotoxic effects on human promyelocytic leukemia, T cell lymphoma and human hepatocellular carcinoma cell lines[J]. Toxicol Lett, 2001, 122(1):81-87.
[7] Jiang XH, Wong BC, Lin MC, et al. Functional p53 is required for triptolide-induced apoptosis and AP-1 and nuclear factor-kappaB activation in gastric cancer cells[J]. Oncogene, 2001, 20(55):8009-8018.
[8] Chang WT, Kang JJ, Lee KY, et al. Triptolide and chemotherapy cooperate in tumor cell apoptosis. A role for the p53 pathway[J]. J Biol Chem, 2001, 276(3):2221-2227.
[9] Yang S, Chen J, Guo Z, et al. Triptolide inhibits the growth and metastasis of solid tumors[J]. Molecular Cancer Therapeutics, 2003, 2(1):65-72
