绒毛蛋白在胃癌及癌前病变中的表达及意义

　　作者：赵成波,周成军,郭建强　　作者单位：1. 山东大学医学院， 济南; 2. 山东大学第二医院消化内科， 济南 ;3. 山东省济阳县人民医院内二科， 济南

　　【摘要】目的 探讨绒毛蛋白(villin)在胃癌及癌前病变组织中的表达特点及其临床病理意义。方法 应用免疫组织化学SP法，观察villin在20例正常胃粘膜、20例肠上皮化生、30例异型增生和60例胃癌组织中的表达情况。结果 Villin在正常胃粘膜中无表达，在肠上皮化生、异型增生和胃癌组织中的表达阳性率分别为85.0%(17/20)，66.7%(20/30)和48.3%(29/60);胃癌中villin的表达与肿瘤的大小、浸润及临床分期和淋巴结转移无关(P>0.05)，而在高-中分化胃癌中较在低分化胃癌中表达明显增高(P<0.05)。结论 Villin在胃粘膜癌变过程中表达下调，且与肿瘤的分化程度密切相关，是研究胃癌分化程度及预后的指标，可以作为肠上皮化生的标志物，对早期癌及重度异型增生的临床筛选具有重要意义。

　　【关键词】 绒毛蛋白,癌前状态,胃癌,免疫组织化学

　　To explore expression of villin in normal gastric mucosa tissues, intestinal metaplasia(IM), dysplasia, and gastric carcinoma and its clinical significance. Methods An immunohistochemical method was used to determine villin expression. Results Villin was expressed in dysplasia cells but not in gastric mucosa. The positive rates of its expression in intestinal metaplasia, dysplasia, and gastric carcinoma were 85.0%(17/20), 66.7% (20/30), and 48.3%(29/60), respectively. It was also found that expression of villin had no relationship to tumor size, invasiveness, and clinical stage and metastasis to lymphnodes(P>0.05), however, expression of villin was significantly higher in well moderately differentiated cancers than in poorly differentiated ones (P<0.05). Conclusion Expression of villin in precancerous lesions and gastric carcinoma is downregulated and is closely related to tumor differentiation degrees. Villin is a good marker for screening different types of gastric carcinoma and has a certain guiding sense to early diagnosis and clinical treatment.

　　Key words： Villin; Precancerous conelitions; Gastric carcinoma; Immunohistochemistry

　　布和免疫定位有着重要的意义。在胃癌发生的早 期阶段，胃粘膜呈现出异常的形态学、免疫学、组织化学和代谢的改变。肠上皮化生引发的慢性萎缩性胃炎、异型增生系公认的癌前病变[3]，尤其是重度异型增生与粘膜内癌有时很难鉴别。本研究应用villin的单克隆抗体检测人正常胃粘膜、肠上皮化生、异型增生和胃癌组织中villin的表达，以探讨其在正常胃粘膜上皮到胃癌转化过程中的表达规律及临床病理意义。

　　1 资料与方法

　　1.1 研究对象 实验材料选取山东大学第二医院病理科及消化内窥镜中心1999～2006年间存档的胃镜活检及胃癌根治术后存档标本130例，其中正常胃粘膜组、萎缩性胃炎伴肠化组各20例，异型增生组30例，胃癌组60例，胃癌病例术前均未接受放疗、化疗。所选病例均经过3位病理医生在多头显微镜下共同诊断，所有标本均经10%福尔马林固定，常规石蜡包埋，4μm连续切片。60例胃癌中，男33例，女27例;年龄36～72岁，平均年龄52.5岁;年龄<60岁者47例，≥60岁者13例;胃癌患者的分期根据WHO(2000)消化系统肿瘤分类标准，癌组织大小、淋巴结转移、浸润深度以术中所见、病理检查、以及术前的辅助检查为准。胃癌组织学分型：高/中分化腺癌28例，低分化腺癌32例;根据肿瘤大小分为：瘤体直径≤5?cm组43例，瘤体直径>5?cm组17例;根据浸润深度分为：侵及浆膜组26例，未侵及浆膜组34例;根据有无淋巴结转移分为：有淋巴结转移组30例，无淋巴结转移组30例;根据临床分期分为：Ⅰ期16例，Ⅱ期18例，Ⅲ期11例，Ⅳ期15例。

　　1.2 主要试剂 鼠抗人抗villin单克隆抗体(编号：70323540C2，克隆号：CWWB1)、SP试剂盒(KIT9710)、DAB显色试剂盒(DAB0031)均购自福州迈新生物技术公司，3%过氧化氢，抗原修复液(枸橼酸钠)。

　　1.3 方法 采用SP法，石蜡切片脱蜡、水化后，以3%过氧化氢阻断内源性过氧化物酶，微波热修复抗原，未免疫马血清阻断非特异性抗原。滴加抗villin单抗，4?℃孵育过夜;PBS冲洗5?min×3次。加入生物素标记的二抗工作液，室温下孵育30?min;PBS冲洗5?min×3次。滴加抗生物素-过氧化物酶连接物(SP)，室温下孵育30?min;PBS冲洗5?min×3次。DAB显色1～3?min，苏木素复染3?min。自来水充分冲洗，酒精水化，二甲苯透明、中性树胶封片。

　　1.4 结果判定 结果分为阳性和阴性两种。细胞浆内出现黄色或棕黄色颗粒为阳性，采用双盲法选取有代表性的腺上皮区域，在100倍高倍镜下，每张切片随机取5个视野计算阳性细胞数，取其平均数，并根据阳性细胞数的多少进行半定量分级，染色结果判断参照Barnes半定量法[4]，即分别对每张切片的阳性细胞数及阳性细胞着色程度进行分级记分，结果以两项乘积表示。染色强度分数标准：无色为0分，淡黄色为1分，黄色为2分，棕黄色为3分;同样物镜观察阳性细胞数，高倍视野阳性细胞数<5%为阴性记0分，5%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分，两者相乘1～4分为弱阳性(+)，5～8分为中等阳性

　　2 结 果

　　2.1 Villin在不同类型病变粘膜中的表达 20例正常胃粘膜内无villin表达。20例肠化生标本中villin表达17例，占85%，均为高表达; villin在肠化腺体顶部的吸收细胞纹状缘呈强表达，在细胞浆中也有弥散表达;在固有层中正常腺体呈阴性表达(图1A)。30例胃粘膜腺体异型增生中villin阳性者共20例，占66.7%;60例胃癌组织中villin阳性表达29例，占48.3%。其中强阳性表达8例，中等阳性9例，弱阳性12例。villin在不典型增生和胃癌粘膜中的表达呈不同分布，异型增生组织中在近腺腔胞浆中表达均匀一致，部分细胞胞浆中呈弥漫或颗粒状着色(图1B,C)。在胃癌组织中，villin在高分化区域表达密度大，而在低分化区域表达减少(图1D)。胃癌组与正常粘膜、肠上皮化生、轻/中度异型增生组之间villin表达差异有统计学意义(P<0.05);但与重度不典型增生组之间无统计学意义(P>0.05)。

　　3 讨 论

　　细胞骨架以不同的形式广泛存在于机体的多种细胞内，构成细胞有支持结构和胞质其它成分的依附支架，以此维持细胞的特定形状和细胞内多种成分的空间位置。近年来的研究进一步证实,细胞骨架还参与细胞的其它重要功能，并且在许多疾病中有过表达现象[5]。

　　Villin基因存在于人类第2号染色体q3536区，由25?000个碱基组成。villin是以单体形式出现的酸性多肽，分子质量为95?kD，是钙离子依赖的具有多种功能的肌动蛋白连接蛋白[67]。它主要在拥有刷状缘结构的消化系统和泌尿系统等上皮有表达[8]， 在肿瘤组织中表达仅限于上皮性肿瘤，具有严格的组织特异性[9]。因此，villin是肠上皮细胞分化和转移性肠腺癌的标志物，可以用来辅助明确转移性肿瘤的来源[1011]，是胃肠道肿瘤相对敏感的特异性标志。

　　本研究结果表明，正常人胃粘膜中没有villin蛋白表达，在肠化生、轻/中度不典型增生、重度不典型增生与胃癌中呈递减表达，差异具有统计学意义(P<0.05)，表明villin在从肠上皮化生至癌变的过程中基因发生了改变，呈现下调表达的趋势，这可能与癌变过程中上皮异常增殖和分化状态降低，正常villin基因突变或者受抑制有关。villin在各级不典型增生间表达差异具有统计学意义(P<0.05)，表明随着细胞异型性的增加，上皮细胞的极性发生紊乱，维持微丝结构的成分表达减少，加速了疾病的进程。本研究结果显示，villin在重度不典型增生与胃癌组之间的表达无差异性(P>0.05)，表明重度不典型增生在某些生物学行为方面已经接近早期癌，因此，我们认为，应特别重视重度异型增生，在临床中应重点筛查此种病例并密切随访。

　　本研究还发现，绒毛蛋白的表达有与胃癌分化程度相关的趋势(中高分化腺癌中表达最高，低分化腺癌中表达比例最低)，提示它是一种很好的肿瘤分化的标志物，有助于预测胃癌的分化程度。villin表达与胃癌的淋巴结转移、浸润深度、临床分期等预后因素之间无联系，提示其可能与肿瘤细胞的粘附、免疫识别、免疫刺激等生物学行为之间无关。Tomar等[1213]体外细胞试验表明，villin C末端磷酸化可明显降低Hela细胞的移动性，但尚不足以证明其与肿瘤细胞转移及侵袭力之间存在必然联系。

　　由于免疫组化技术的局限性，本研究只能定性检测出villin的表达而不能定量及说明其功能活性，相信随着蛋白组学和转基因技术等的不断发展，一定可以从更深层面揭示其在肿瘤发生、发展及转移中的作用及其作用机制。

　　【参考文献】

　　[1] 〖ZK(#]王庸晋， 张联珠，车德才.医学细胞生物学[M].北京：科学出版社，2002:218219.

　　[2] 汪盚仁，薛绍白.细胞生物学[M].第2版.北京：北京师范大学出版社，2002:125126.

　　[3] 萧树东.江绍基胃肠病学[M].上海：上海科技出版社，2001:631632.

　　[4] Barnes D M, Dublin E M, Fisher C J, et al. Immunohistochemical detection of P53 protein in mammry carcinoma:an important new independent indictor of prognosis[J]. Hum Pathol, 1993, 24(5):46976.

　　[5] Chakravarti R, Sapountzi V, Adams J C. Functional role of syndecan1 cytoplasmic V region in lamellipodial spreading, actin bundling,and cell migration[J]. Mol Biol Cell, 2005, 16(8):36783691.

　　[6] RousseauMerck M F, SimonChazotes D, Arpin M, et al. Localization of the villin gene on human chromosome 2q35q36 and on mouse chromosome1[J]. Hum Genet, 2005, 78(2):130133.

　　[7] Yokota E, Tominaga M, Mabuchi I, et al. Plant villin, lily P135ABP, possesses Gactin binding activity and accelerates the polymerization and depolymerization of actin in a Ca2+sensitive manner[J]. Plant Cell Physiol, 2005, 46(10):16901703.

　　[8] Robine S, Huet C, Moll R, et al. Can villin be used to identify malignant and undifferentiated normal digestive epithelial cell?[J]. Proc Natl Acad Sci USA,2003, 82(24):84888492.

　　[9] Mizoshita T, Tsukamoto T, Tanaka H, et al. Colonic and smallintestinal phenotypes in gastric cancers: relationships with clinicopathological findings[J]. Pathol Int, 2005, 55(10):611618.

　　[10] Zavros Y, Eaton K A, Kang W, et al. Chronic gastritis in the hypochlorhydric gastrindeficient mouse progresses to adenocarcinoma[J]. Oncogene, 2005, 24(14):23542366.

　　[11] Suh N, Yang X J, Tretiakova M S, et al. Value of CDX2, villin,and alphamethylacyl coenzyme A racemase immunostains in the distinction between primary adenocarcinoma of the bladder and secondary colorectal adenocarcinoma[J]. Mod Pathol, 2005, 18(9):1217.

　　[12] Tomar A, George S, Khurana S. Interaction of phospholipase Cgammal with villin regulates epithelial cell migration. The Journal of Biological Chemistry[J] . Biol Chem, 2006, 281(42):3197232986.

　　[13] Wang Y, Tomar A, George S P, et al. Obligatory role for phospholipase Cgamma(1) in villininduced epithelial cell migration[J]. Am J Physiol Cell Physiol, 2007, 292(5):17751786.