半定量RTPCR法测定TRAIL、survivin在胃癌组织中

　　作者：王小红　　作者单位：丹阳市人民医院 消化内科，江苏 丹阳 212300

        Abstract:Objective To investigate the expression of tumor necrosis factorrelated apoptosisinducing ligand(TRAIL)and survivin in gastric carcinoma.Methods Expression of TRAIL and survivin were assayed by semiquantitive reverse transcriptase polymerase chain reaction(RTPCR)in 82 cases of gastric carcinoma and normal gastric tissues.Results The positive rate and expression quantity of TRAIL in normal tissues were higher than those in cancer tissues(P<0.05).However，the survivin was only expressed in cancer tissues,the positive rate was 62.2%.The expression quantity of TRAIL and survivin was correlated with histological grade，the expression of TRAIL was higher in welldifferentiated gastric adenocarcinoma than that in poorly differentiated gastric adenocarcinoma while the expression of survivin was lower(P<0.05).Conclusion TRAIL can induce apoptosis and survivin can depress the happening of apoptosis，which may be one of the mechanisms by which gastric carcinoma develops.

        Key words:gastric carcinoma;tumor necrosis factorrelated apoptosisinducing ligand;survivin;reverse transcriptase polymerase chain reaction

　　肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(tumor necrosis facterrelated apoptosisinducing ligand,TRAIL)是TNF超家族中的成员，属Ⅱ型跨膜蛋白，因其具有大量、快速地诱导转化细胞、肿瘤细胞及病毒感染细胞发生凋亡，而对大多数组织细胞没有毒性的特性[1]，使其在肿瘤的治疗中具有较重要的研究价值。Survivin是凋亡蛋白抑制因子家族(inhibitor of apoptosis proteins,IAPs)新成员，可抑制多种凋亡刺激因子引起的凋亡，是迄今发现的最强的凋亡抑制因子之一，可在多种肿瘤组织中表达[2]。本研究以半定量逆转录聚合酶链反应(RTPCR)的方法检测胃癌及正常胃组织中TRAIL和survivin mRNA的表达情况,探讨二者的表达与胃癌的关系。

　　1 材料与方法

　　1.1组织标本收集2005年6月至2006年6月在丹阳市人民医院及南通大学附属医院住院手术治疗的82例胃癌患者手术切除的肿瘤组织,其中男50例,女32例,切下的标本分两份,一份立即置液氮速冻后于-80℃保存备用，另一份作病理检查。其中高分化腺癌19例,中分化腺癌30例,低分化腺癌33例。同时收集距癌组织5cm以上正常胃组织作正常对照。

　　1.2仪器与试剂Trizol及焦碳酸二乙酯购自上海华舜生物工程有限公司。RTPCR一步法试剂盒购自晶美生物工程公司，其中逆转录酶、Taq酶及dNTP均为Finnzymes公司产品。凝胶电泳摄像仪为Panasonic公司产品，凝胶定量分析软件捷达801为江苏省捷达科技公司产品。

　　1.3引物设计与合成从GenBank查取基因序列，以Primer5软件设计TRAIL、survivin及内参βactin的引物各一对，其序列分别为：TRAIL上游5′GGAACCCAAGGTGGGTAGAT3′，下游5′TCTCACCACACTGCAACCTC3′;survivin上游5′TACGCCTGTAATACCAGCAC3′，下游5′TCTC CGCAGTTTCCTCAA3′;βactin上游5′AAGTACTC CGTGTGGATCGG 3′，下游5′ATGCTATCACCTCCCCT GTG 3′。扩增片段大小分别为192、217和495bp。上述引物均由上海生工生物技术服务有限公司合成。1.4RNA样品的提取(1)称取从-80℃冰箱中取出解冻后的胃癌及正常胃组织各20～30mg置入匀浆器,加入1ml Trizol,室温下充分匀浆后倒入1.5ml离心管,静置5min;(2)加入0.2ml氯仿,振荡15s,室温静置5min;(3)4℃、12000g×15min离心,取上清液至另一1.5ml离心管;(4)加入0.5ml异丙醇,将管中液体轻轻混匀,室温静置10min;(5)4℃、12000g×10min离心后弃上清;(6)加入1ml 4℃预冷过的75%乙醇,轻轻洗涤沉淀，4℃、7500g×5min离心,弃上清，同法再洗一遍;(7)开盖室温晾干后加入适量焦碳酸二乙酯水溶解(可65℃促溶15min)。如暂不做RTPCR可先于-80℃冰箱保存。1.5RTPCR实验取焦碳酸二乙酯处理过的0.5ml离心管，每管加入10×Reaction Buffer 5μl，50mmol•L-1 MgCL21.5μl,10mmol•L-1的dNTP 1μl，RNA抑制剂1μl，10pmol•L-1的上下游引物各1μl，5U•μl-1的逆转录酶1μl，1U•μl-1的Taq酶2μl以及模板RNA 1μg,最终加焦碳酸二乙酯水至50μl。每对引物各做2管。PCR的反应条件均相同，即各扩增管先置于55℃水浴逆转录40min，然后直接置PCR扩增仪94℃变性 45s,54℃退火45s，72℃延伸60s,共40个循环，再72℃延伸5min。以不加模板的反应管作为空白对照。1.6PCR产物的电泳鉴定及半定量分析取10μl PCR扩增产物及2μl0.2%溴酚兰混匀后，加样于1.7%的琼脂糖凝胶，同时选一孔加标准Marker，在含有溴乙淀的TBE缓冲液中以120V电压电泳20min后观察结果。用摄像仪将含有产物条带的电泳图谱扫入电脑，以捷达801分析软件中的“凝胶分析软件”对条带进行分析，读取其积分光密度值(IOD值)，以TRAIL或survivin平均IOD值/βactin平均IOD值来表示TRAIL或survivin的相对表达强度，从而对TRAIL及survivin的表达强度作半定量分析。1.7统计学处理运用State7.0软件对相关数据进行统计学处理。计量资料采用x-±s表示，两两比较采用t检验;率的比较用χ2检验。

　　2 结 果

　　2.1 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果将TRAIL、survivin及内参βactin的RTPCR产物进行琼脂糖凝胶电泳后，其条带与标准Marker相比较，结果表明引物有较好的特异性，只有一条产物带，且其分子量大小与预先设计的相一致，见图1。同时从所有标本RTPCR扩增结果看，正常胃组织中TRAIL均表达，而survivin均不表达。TRAIL及survivin在胃癌及正常胃组织中的表达率见表1。M.DNA Marker;1.βactin;2.TRAIL;

　　2.2TRAIL及survivin阳性表达者半定量结果每份标本均以TRAIL、survivin及βactin 3对引物作RTPCR扩增，每对引物做两管，其半定量结果见表1。胃癌组织44例TRAIL表达者其相对表达量为0520±0.10;82例正常胃组织TRAIL均表达，其相对表达量为0.783±0.17，与胃癌组织相比半定量结果的差异有统计学意义(P<0.05)。胃癌组织51例survivin表达阳性者其相对表达量为1.038±0.11;正常胃组织均不表达survivin，胃癌组织的表达量明显高于正常胃组织(P<0.05)。表1TRAIL及survivin在胃癌及正常胃组织中的表达情况

　　2.3TRAIL及survivin相对表达量与胃癌分化程度的关系TRAIL及survivin在3种不同分化程度的胃腺癌中的阳性表达率两两比较，差异均无统计学意义(均P>005)。但从其半定量结果看，在低分化腺癌TRAIL的相对表达量(0.478±0.09)要明显低于高分化腺癌(0.551±0.11)(P<0.05)，而survivin在低分化腺癌的相对表达量(1.081±0.125)则明显高于高分化腺癌(0.995±0.08)(P<0.05)。TRAIL及survivin在高分化腺癌中的相对表达量与中分化腺癌比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。表2 TRAIL及survivin相对表达量与胃癌分化程度的关系：括号内为百分率

　　3 讨 论

　　人类TRAIL基因定位在染色体3q26,cDNA全长1.05kb,编码281个氨基酸 [1]。其功能部位是胞膜外区第119～241位氨基酸,通过形成可溶型的同源三聚体亚结构与其受体结合而发挥生理效应。目前已经确认与TRAIL结合后能诱导细胞凋亡的受体主要为死亡受体(death receptor，DR),包括DR4(TRAILR1)、DR5(TRAILR2),均含死亡结构域并能向细胞内传递死亡信号,与TRAIL结合后DR4或DR5通过其胞外区与结构域结合并活化,其胞内的死亡结构域相互聚集,并进一步通过同嗜作用募集结合器蛋白,后者接受死亡受体传递的凋亡信号后将引起胞内caspase的前体在其末端的局部募集和串联结合,从而形成凋亡酶体(apoptosome)。凋亡酶体形成后其分子通过自身水解而成为有活性的caspase,并进一步激活caspase级联反应。TRAIL在多数肿瘤组织中低水平表达[34]，可能与肿瘤的发生及发展有一定的相关性。本研究胃癌组织中TRAIL的表达水平比正常胃组织中低，表明胃癌发生过程中通过TRAIL途径所诱导的细胞凋亡不足。在胃癌发生过程中TRAIL表达受到抑制,从而促进了肿瘤的发生、发展,提示TRAIL与胃癌的发生有关。TRAIL在不同分化程度的癌组织中的表达有差异。细胞分化程度愈差,TRAIL表达愈弱,在高分化癌组织中的表达量最大,在低分化癌的表达最低，二者相比差异有统计学意义(P<0.05)，表明TRAIL的表达与细胞的分化有关，TRAIL低表达可能是分化差的标志。Survivin基因定位于人染色体17q25.3区，基因全长15kb，编码含有142个氨基酸、相对分子质量为165×103的胞浆蛋白。作为最强的凋亡抑制因子之一，survivin主要通过以下方式直接或间接抑制caspase活性而发挥抗凋亡作用：(1)survivin黏附于活化的caspase3或caspase7;(2)survivin直接结合caspase9;(3)survivin封闭辅助性线粒体源性caspase激活因子(second mitochondriaderived activator of caspase,SMAC)，保护IAPs成员免受其抑制;(4)survivin增强IAPs家族其他成员功能，对抗SMAC的作用;(5)survivin还能在细胞有丝分裂前期通过与纺锤体微管发生特异性结合反应间接抑制caspase对纺锤体的水解作用，有利于保护有丝分裂细胞器的完整性，使细胞逃避细胞周期G2/M期检测点(checkpoint)的监控，抵抗因DNA损伤或突变自身诱导的细胞凋亡，从而导致细胞异常分裂增殖[56]。IAP蛋白可阻止各种细胞凋亡,survivin作为IAP家族成员也已发现表达于多种肿瘤组织中，且其表达的高低与肿瘤患者的预后及肿瘤侵袭程度密切相关，表达越高预后越差，肿瘤侵袭越明显[78]。本研究82例胃癌中51例(62.2%)有survivin阳性表达,而正常胃组织无表达,且其相对表达量随组织分化程度降低而增强,说明survivin的表达强度明显影响肿瘤的恶性程度,可在一定程度上提示胃癌的预后。细胞凋亡过度及凋亡不足均会对机体造成不利的影响，发生转化的细胞不能及时凋亡是肿瘤发生的重要原因之一，胃癌的发生和发展取决于多种促凋亡基因和抑凋亡基因的体内平衡。TRAIL选择性杀伤靶细胞的特性使其在肿瘤治疗方面有着诱人的前景,Du等[9]以抗survivin寡核苷酸转染甲状腺髓样癌细胞系TT，表明其可抑制survivin表达，促进细胞凋亡，明显降低癌细胞的存活率。TRAIL和survivin在胃癌组织中的检测为进一步了解TRAIL及survivin在胃癌发生过程中的作用机制及为两者作为生物治疗及基因治疗的靶点提供了理论基础。

　　【参考文献】

　　[1]Griffith T S，Lynch D H.Trail:a molecule with multiple receptor and control mechanisms[J].Curr Opin Immunol，1998，10(5):559563.

　　[2]Ito T，Shiraki K，Sugimoto K，et al.Survivin promotes cell proliferation in human hepatocellular carcinoma[J].Hepatology，2000,31(5):10801085.

　　[3]Fukuda M，Hamao A，Tanaka A,et al.Tumor necrosis factorrelated apoptosisinducing ligand(TRAIL/APO2L)and its receptors expression in human squamous cell carcinoma of the oral cavity[J].Oncol Rep,2003,10(5):11131119.

　　[4]肖明兵,黄介飞,倪润洲.TRAIL、TRAILR在原发性肝癌及其癌旁组织中的表达[J].江苏医药，2006,32(1):13.

　　[5]Lu C D,Altieri D C,Tanigawa N.Expression of a noval antiapoptosis gene,survivin,correlated with tumor cell apoptosis and p53 accumulation in gastric carcinomas[J].Cancer Res,1998,58(9):18081812.

　　[6]Andrade F,Roy S,Nicholson D,et al.Granzyme B directly and efficiently cleaves several downstream caspase substrates:implications for CTLinduced apoptosis[J].Immunity,1998,8(4):451460.

　　[7]KarczmarekBorowska B,Filip A,Wojcierowski J,et al.Survivin antiapoptotic gene expression as a prognostic factor in nonsmall cell lung cancer:in situ hybridization study[J].Folia Histochem Cytobiol，2005,43(4):237242.

　　[8]Shariat S F,Lotan Y,Saboorian H,et al.Survivin expression is associated with features of biologically aggressive prostate carcinoma[J].Cancer，2004,100(4):751757.

　　[9]Du Z X,Zhang H Y,Gao da X,et al.Antisurvivin oligonucleotides inhibit growth and induce apoptosis in human medullary thyroid carcinoma cells[J].Exp Mol Med,2006,38(3):230240.