脑血管痉挛中缝隙连接蛋白Cx43磷酸化位点分析及S368位点与其关系的研究

在心脑血管系统中主要表达和起重要作用的缝隙连接蛋白是C热3,其磷酸化在缝隙连接通道的组装和决定通道传导方面起着重要的作用,并由此影响着多种心脑血管疾病的发生与发展。但是,其发生磷酸化的氨基酸位点不同及不同位点磷酸化后对缝隙连接功能的影响不一样囵,且不同位点的磷酸化信号通路途径也不同,因此,研究其磷酸化位点可帮助学者们更加深人了解Cx43磷酸化在心脑血管疾病病理生理过程中的作用。本实验利用质谱技术分析蛛网膜下腔出血(SAH)后脑血管痉挛中Cx43发生磷酸化的氨基酸位点,并利用特异的磷酸化位点抗体对其磷酸化水平进行分析,同时利用数字减影血管造影技术(DSA)观察基底动脉直径变化,探讨其s368位点是否与脑血管痉挛相关,此将为人们更深人研究Cx43磷酸化参与sAH后脑血管痉挛的机制奠定坚实的基础。

材料与方法

—、动物及主要试剂、仪器

新西兰纯种健康清洁级大白兔78只,雌雄各半,5~6月龄,体质量2.5~3.5炖,由南昌大学医学院动物科学部提供。主要试剂包括:兔抗磷酸化Cx43(SCr368)(一抗)购自美国Cc11sialling公司;缝隙连接阻断剂甘珀酸⒆BX)购自美国⒏glna公司;兔抗G2屮DH(内参)购自美国Chcmicon公司;磷酸化蛋白富集试剂盒购自德国Qiagcn公司;定影液、显影液、胶片购自日本Koda公司。主要仪器包括:质谱仪购自美国Themo Fimigall公司;台式低温高速离心机购自美国Siglna公司;数字减影成像系统购自德国Simclls公司;垂直电泳仪、电转仪系统购自美国Bio求ad公司。

二、实验分组

大白兔78只按随机数字表法分为4组:(1)正常对照组lPl=6);⑿)单纯脑池注血组lJ,=24);o)CBX脑池处理组rzl=260;“)溶媒脑池处理组l,n=24).以上各组(除正常对照组外)进一步按随机数字表法分成4亚组,每亚组6只,分别于成功建模后1d、3d、7 d、14d应用Westem blo钆ing方法检测兔基底动脉Cx43磷酸化水平。

三、实验性sAH后脑血管痉挛模型的建立及各组取材

单纯脑池注血组、CBX脑池处理组、溶媒脑池处理组动物采用枕大池二次注血法制成SAH后脑血管痉挛模型。应用戊巴比妥20mkg)耳缘静脉注射麻醉动物,取侧卧位,局部消毒。用无菌的25号针头穿刺枕大池,释放约1.5mL脑脊液后,将预先采集的自体非抗凝耳动脉血缓慢注入枕大池,然后立即将动物头低30°,持续15min。次日重复此操作。正常对照组同样进行穿刺并注人0.5 mLg生理盐水。CBX脑池处理组在枕大池二次注血后⒛min经枕大池缓慢注入CBX2501mol/kg,第2天、第3天重复给药。溶媒脑池处理组应用生理盐水代替CBX,按照以上同样方法、剂量注入脑池内。在相应时间点,各组动物用戊巴比妥过量麻醉后,立即断头取脑,置人4℃的K-H液中,同时通人混合气体(95%o2、5%COn),在显微镜下完整分离基底动脉,快速去除周围的蛛网膜及血管腔内残留血液,放入液氮中速冻,然后转入-80℃冰箱冻存。

四、质谱鉴定脑血管痉挛模型中Cx43的磷酸化位点

1,提取各组中的磷酸化总蛋白:按磷酸化蛋白富集试剂盒方法富集磷酸化蛋白。首先将875uL的CHAPs原液加到35mL的磷酸化蛋白的裂解缓冲液中配成含CHAPS为0.25%的工作液A;同样将75uL的CHAPs原液加到3mL的磷酸化蛋白的洗脱缓冲液中配成含CHAPS为0,25%的工作液B;取5mL的工作液A,在其中分别加人10uL的BcllzOnasc原液和一片蛋白酶抑制剂片,充分溶解并混匀,配成工作液。将各组的脑基底动脉放人两个手动匀浆器中,并分别加人上述配好的工作液C 350uL,迅速将其置于冰盒上手动匀浆,使脑基底动脉充分裂解。然后,取-2mL EP管,将上述匀浆好的基底动脉吸入并加入1500uL的工作液C,手动混匀后置于4℃冰箱中孵育30min,并每隔10分钟震荡一下。孵育30min后,4℃离心机中10000×g的速度将其离心30min。在离心期间将磷酸化蛋白富集柱的下端用剪刀剪开,让柱子里的缓冲库流干,然后再在柱子中加入I作液A,同样让其流干。离心30min后收集上清液,并在上清液中加人I作液A,使其终体积为15mL。将上述15mL的蛋白液中的一半加入到准各好的磷酸化蛋白富集柱,让其充分流过磷酸化蛋白富集柱,同样将另外一半也通过磷酸化蛋白富集柱。取工作液A6mL加入到上述准各好的磷酸化蛋白富集柱中,并让其充分流过柱子c取工作液B500uL,将其加入到上一步准备好的柱子中,让其充分流过柱子.重复上述实验流程4次。收集流过柱子的工作液B,此即为富集到的磷酸化总蛋白。将富集到的磷酸化总蛋白浓缩后放置于80℃冰箱中保存.

2.Cx43磷酸化位点的鉴定:将上述提取的单纯脑池注血组磷酸化总蛋白进行垂直电泳,电泳条件为:120V恒压电泳约15min,至溴酚蓝进入分离胶,随后改为160V恒压电泳约75min,待溴酚蓝至胶底时停止。将上述含有磷酸化Cx43的sDS胶条带进行考马斯亮蓝染色,后在43位置将含有磷酸化Cx43的sDS胶条带切下。将上述带有磷酸化Cx43蛋白的sDs-PAGE胶条带分别切成约1mm3的胶粒,并用脱色液(50%ACN:25mmo1/L NH+HC⒐=1:1)100mL将其脱色完全,再将其干燥脱水完全,后利用二硫苏糖醇lDTT)将其烷基化。烷基化完全后利用胰蛋白酶对其进行酶切以获取Cx43肽段,最后将获取的肽段上质谱仪进行磷酸化位点的分析。

五、Wcstcm blo⒒ing检测各组Cx43S368位点磷酸化水平

取上述各组中富集到的磷酸化总蛋白⒛uL上样,积层胶电泳15min,电压120V;分离胶电泳45min,电压180V;转膜⒇min,电流350mA;5%TBST脱脂奶粉室温下封闭2h;按抗体:5%TBST脱脂奶粉=1△O00的比例配好孵育液,4℃孵育Cx43 S368一抗过夜;将孵育好一抗的膜用TBST液洗3遍,每10分钟一次,后按抗体:5%TBST脱脂奶粉=1∶1000的比例配好孵育液,室温下孵育二抗4h;将孵育好二抗的膜用TBST液洗3遍,每10分钟一次,后曝光。

六、脑血管造影

七、各组动物分别在SAH前及成功建模后第7天(取材前)行DSA检查:30酽L戊巴比妥静脉麻醉动物,取仰卧位,用软纱布条将动物四肢固定于造影床上,右侧腹股沟区各皮并常规消毒。于右侧腹股沟下方切开皮肤及软组织以暴露股动脉,带芯导引鞘管插人股动脉,拔除鞘管芯后立即将5F导管经鞘管插入股动脉,在透视下将导管送至主动脉弓,然后向左后上方转动导管将其送至左侧椎动脉入口。在相同放大率下注入欧乃派克2mL后行DSA检查。整个过程保持动物自主呼吸及心跳平稳。基底动脉的直径应用计算机影像分析系统fNIH Imagc xer⒍on 1,62)进行测量,每个基底动脉图像取≡个测量点:两侧椎动脉汇合点上方0.1mm处、基底动脉中点及基底动脉顶端下方0.1mm处,三个测量点的平均值作为基底动脉的直径值。将两次造影的测量结果进行比较所得百分比值作为最终统计数据。

七、统计学分析

八、采用sPsS13,0统计软件处理数据。计量资料采用均数±标准差表示,比较采用重复测量的方差分析及单因素方差分析。以P剞.05示差异有统计学意义。

结果

一、缝隙连接蛋白Cx43磷酸化位点的鉴定

本研究利用质谱技术对富集到的Cx43磷酸化总蛋白进行磷酸化位点检测,成功鉴定到脑血管痉挛中Cx43有4个位点发生磷酸化,其分别为Y265、S364、s365、S368(图1)。

二、各组Cx43S368位点磷酸化水平分析(1)正常对照组基底动脉Cx43S368位点磷酸化表达处于较低水平(170%夕·3%)。⑿)单纯脑池注血组及溶媒脑池处理组与正常对照组相比,Cx43 S368位点磷酸化水平在1d、3d、7d、14d各时间点均显著升高(单纯脑池注血组:1d:54.3%±8,3%,3 d:78.5V。±6.0o/o,7 d:165.39汔±5,7V。,14 d:90.5V。±6.7%;溶媒脑池处理组:1d:519%±8.4%;3d:80,1%±5,2%;7d:1638%±8.0%;14d:89,5%乡,5%),差异有统计学意义臼啕05);且磷酸化水平于1d、3d依次增高,7d达最高值,14d表达开始下降,表现出时间上的相关性。l~s,CBX脑池处理组各时间点基底动脉C热3s368位点磷酸化水平显著低于单纯脑池注血组及溶媒脑池处理组(1d:”9%±4·5%,3d:46,1%±5.8%,7d:456%±4.6%,14d:勿,5%±3.2%),差异有统计学意义臼钊.0j)。(图⑷,

三、各组基底动脉痉挛情况

正常对照组第二次与首次造影基底动脉直径的百分比值平均为1%±13%,单纯脑池注血组、CBX脑池处理组、溶媒脑池处理组分别为661%±7,2%、91,3%±5.3%、637%诵.6%,4组基底动脉直径的百分比值总体比较差异有统计学意义)。(1)单纯脑池注血组与正常对照组相比显示基底动脉直径显著狭窄,差异有统计学意义),表明成功建立兔sAH后脑血管痉挛模型。⑿)单纯脑池注血组、溶媒脑池处理组之间基底动脉直径无明显变化,差异无统计学意义臼刈,05),表明溶解CBX的液体未对sAH后脑血管痉挛模型的基底动脉直径造成影响。l3rBx脑池处理组基底动脉直径显著狭窄于单纯脑池注血组,差异有统计学意义(R0.05),表明脑池内注入CBX对枕大池二次注血后的基底动脉收缩产生了显著扩张作用,缓解了脑血管痉挛。各组DSA检查结果具体见图3。

讨论

SAH后脑血管痉挛是患者致死、致残的重要原因,尽管人们对其进行了大量的临床和实验研究,但其具体机制至今未明囵。研究表明,SAH后多种致痉物质如氧合血红蛋白、内皮素-1rET-1)等诱导致痉信号沿脑血管壁横向和纵向的传导播散是引起和维持脑血管痉挛的重要分子机制囵,因此通过研究脑血管壁细胞间的信号传导机制,可能为脑血管痉挛的治疗开拓一个新领域。缝隙连接作为一种直接的细胞间信号交流通道,本课题组前期研究已表明其通过参与各种致痉信号的传导与调节在脑血管痉挛的发生、发展过程中起到重要作用。构成缝隙连接的基本单位为缝隙连接蛋白,在脑血管壁上其主要由缝隙连接蛋白Cx43组成。缝隙连接蛋白修饰的改变将直接导致缝隙连接功能发生变化,其中最重要的修饰方式为磷酸化。然而,不同的缝隙连接蛋白其磷酸化的氨基酸位点不同且不同位点对缝隙连接功能的作用不一样,有的位点可以使缝隙连接功能增强,有的使其功能减弱。目前,研究表明Cx43总共有I5个位点可以发生磷酸化,而本实验利用质谱技术第一次成功鉴定出脑血管痉挛中缝隙连接蛋白Cx43发生磷酸化的4个位点(Y265、S3“、S365、S368),虽然目前对这些磷酸化位点在脑血管痉挛中的具体作用还不得而知,但鉴定出来的这些位点将会为学者们进一步研究Cx43磷酸化参与脑血管痉挛的机制研究打下坚实基础.此外,本实验利用特异的Cx43S368位点抗体,通过Westem b1o⒒ing方法分析了脑血管痉挛中其位点磷酸化水平的改变。S368位点作为目前人们已知的最为重要的缝隙连接蛋白Cx43的磷酸化位点,其在多种心脑血管疾病中扮演着重要角色Ⅱ"明。然而,在不同疾病中其磷酸化水平的改变不一样,如在心率失常中其磷酸化水平降低,而在心肌缺血中则相反llb1刨。本研究发现脑血管痉挛中其磷酸化水平升高,而利用缝隙连接阻断剂CBX后其磷酸化水平降低,同时对其脑血管进行造影发现基底动脉收缩缓解。这表明Cx43s368位点在脑血管痉挛中可能起到重要作用。人们在大鼠`心肌细胞中应用佛波酯TPA(12-otC仕adccalloylpllo1·bo113-acetatcl(—种蛋白激酶C的激活剂)激活蛋白激酶C使Cx43磷酸化,发现其可增加总的缝隙连接传导性,而同时人们发现由Cx43构成的缝隙连接通道对大分子有明显的选择性通透Ⅱ刀,而多数收缩信号由大分子物质组成。因此,结合本实验结果笔者认为,SAH后多种因素作用使Cx43S368位点磷酸化水平升高,导致由Cx43构成的缝隙连接通道的通透性升高,平滑肌细胞间通过的收缩信号增加,从而引起脑血管持续性的痉挛。同时笔者认为CBX缓解脑血管痉挛的机制有可能是降低了Cx43s368位点的磷酸化水平,使通过Cx43的收缩信号减少,从而使脑血管痉挛得到缓解。然而,本实验中筛选出来的Cx43的4个磷酸化位点中,除S368位点参与了脑血管痉挛外,其他3个位点是否也一同参与脑血管痉挛的病理过程尚不得而知,这还有待进一步研究,并且,磷酸化Cx43s368位点的蛋白激酶途径也还需要在将来的实验中加以明确。

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