17β-雌二醇对解聚素金属蛋白酶9表达水平的影响

阿尔茨海默病(AD)是老年常见的中枢神经系统退行性疾病,临床表现为记忆力降低及认知障碍等凹。AD发病具有明显的性别差异,女性AD患病率高于男性,此高风险性与绝经后女性脑内雌激素水平下降有关网。α-分泌酶解聚素金属蛋白酶9(ADAM9)切割日淀粉样前体蛋(APP)后能够阻止神经毒性件淀粉样多肤的生成和沉积上调a一分泌酶表达或增强其活性是治疗AD的有效方法。雌激素能够上调。一分泌酶活性，增强其对APP的酶切作用[5]，但其作用机制仍不明确。本实验研究17β-雌二醇对ADAM9启动子表达水平的影响及作用机制，从基因水平探讨雌激素上调cx一分泌酶活性的作用通路，为明确雌激素替代治疗在AD发病中的保护作用提供实验依据

材料与方法

一、材料

质粒pGL3-Basic,pGL3-Control,pRL-TK和绿色荧光蛋白(GFP)均由山东大学免疫教研室提供，SK-N-SH细胞、HEK293细胞和HeLa细胞购自上海中科院细胞库，T4连接酶、限制性内切酶购白大连宝生物工程公司，凝胶回收试剂盒、感受态细胞购自北京鼎国生物技术公司，去内毒素质粒提取试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司，17β-雌二醇购自美国Sigma公司，荧光素酶检测试剂盒购自美国Promega公司，DMEM、胎牛血清、脂质体Lipofeetamine2000等购自美国Invitrogen公司。

二、扩增ADAM9基因启动子目的片断抽取健康人静脉血10 mL，应用盐析法提取基因组DNA。用Primer Premier 5软件设计引物，两端分别加人勒nI和兔l II识别序列及相应保护碱基(表1).用标准PCR方法扩增ADAM9基因启动子目的片段，用直接测序的方法进行证实

三、构建报告基因质粒用却nI和Bgl II分别双酶切pGL3-Basic质粒和.9 DA M9目的片断，按凝胶回收试剂盒操作说明进行DNA纯化、回收。用T4连接酶连接质粒和目的片断，将连接后产物直接转化大肠杆菌DH-5a,扩增和提取连接成功的报告基因质粒，并用双酶切和PCR方法进行鉴定。

四、细胞培养和细胞转染应用含10%胎牛血清的EMEM培养基培养人神经母细胞瘤细胞SK-N-SH,应用含5%胎牛血清的DMEM培养基培养人胚肾细胞HEK293和宫颈癌细胞HeLa,34d更换一次培养基。待细胞生长状态良好后，用2.5 g/L胰酶进行消化，铺96孔板。细胞达到80%}90%融合后，用脂质体Lipofectamine 2000进行质粒转染。在此过程中，pGL3-Basic质粒作阴性对照，pGL3-Control质粒作阳性对照

五、雌激素处理细胞各组细胞铺96孔板24 h后，每孔中加入不同浓度的17β-雌二醇，终浓度分别为1.0 nmol/L,10 nmol/L和50 nmol/L，荧光酶标仪检测各孔吸光度(A)值，选择对细胞活力有轻微影响但又可保证细胞正常表达外源蛋白的浓度来作为最后的工作浓度。采用最适浓度17p一雌二醇处理转染后24 h细胞。

六、相对荧光素酶活性检测及分析雌激素处理细胞24 h后，采用双荧光素酶报告基因系统检测ADAM9启动子活性。此系统中包括两种质粒:pGL3-Basic不含启动子而含萤火虫荧光素酶cDNA的报告质粒，它在外连启动子片断的驱动下表达萤火虫荧光素酶，使底物发出绿色荧光，荧光的强弱反映萤火虫荧光素酶的活性(luciferase activity of firefly,LAF);pRL-TK质粒可表达海肾荧光素酶，使同样的底物发蓝色荧光，反映海肾荧光素酶的活性(luciferase activity of renilla,LAR)。此过程中该系统先后向每孔中加人了100 p,L LAR II(读取LAF数值)及100},L淬灭剂，读取相对荧光素酶活性(relative luciferase activity,RLA)数值，记录所有数据。每次每种质粒至少铺孔6个.相同实验重复至少3次。七、统计学方法各组RLA采用均数士标准差任士、)表示，数据处理采用SPSS 16.0统计软件，方法采用两样本t检验，P<0.05示差异有统计学意义。

结果

一、A DA M9启动子片段扩增结果扩增后目的片段长度为i 676 by，位于翻译起始密码子ATG上游一1492 by至下游+184 by区域。

二、报告基因质粒构建情况利用基因重组、扩增技术成功构建了ADAMS启动子报告基因质粒pGL-ADAMS。菌落PCR电泳结果初步证实极可能连接成功的阳性克隆(图1);内切酶仰nI和Bf彝II对可能的阳性克隆进行双酶切后进一步证实、鉴定了阳性克隆(图2);最后经测序证实成功构建了pGL-ADAM9质粒。

三、最适17β-雌二醇浓度的确定转染后24 h，用不同剂量的17β-雌二醇作用细胞24 h，用四氮(MTT)法计算细胞活力，并且用存活细胞数与0.074 mm2面积中的总细胞数比值来表示。最终确定10 nmol/L为最适工作浓度，此浓度下细胞活力都在80%以上。

四、17β-雌二醇对ADAM9表认的影响细胞转染24 h后，应用浓度为10 nmol/L的17β-雌二醇处理细胞24 h。可以看到SK-N-SH细胞内八DAM9启动子转录活性上升至31.250士1.328，较处理前的15.471士1.256增加约2倍，差异有统计学意义(t=19.249,P=0.000)a HEK293细胞内，A DA M9启动子转录活性上升至13.499士0.866，较处理前的8.513士1.356增加约1.6倍，差异有统计学意义(t=7.017,P=0.000)。但是HeLa细胞中没有观察到雌激素对ADAM9启动子转录活性的影响，17β-雌二醇处理前ADAM9启动子转录活性为7.893 t 1.257，处理后活性为8.692士0.662，差异无统计学意义(t=1.234,P=0.051)(图3)

讨论

流行病学调查发现，AD发病具有明显的性别差异，女性AD患病率高于男性，65岁以上女性摧患AD风险较年龄匹配组男性高约2倍，女性AD患者具有更严重的认知功能缺陷和神经病理变化[6]。女性摧患AD的高风险性与绝经后女性脑内雌激素水平下降有关。一些临床试验已经证实，雌激素替代治疗能够改善认知功能，延缓并降低女性发生AD的危险性。基础研究发现，雌激素能够调节。一分泌酶活性，增强其对APP的酶切作用，降低体外和体内神经元产生的A3水平，并减少诱导的神经毒性、细胞凋亡和氧化应激反应，同时增加具有神经保护和神经营养作用的可溶性淀粉样前体蛋白a生成[}8}ADAM9是。一分泌酶的重要成员之一，因此推测:雌激素通过上调ADAMS的表达水平，增强其对APP的。一分泌酶酶切作用，降低AD的发病风险。目前，国内外尚少见此方面的相关报道:本实验中采用17β-雌二醇处理SK-N-SH细胞和HEK293细胞后，pGL-ADAMS的转录活性都较处理前增加了2倍左右。雌激素能够与细胞内的雌激素受体(estrogen receptor,ER)结合，形成激素一受体复合物，将雌激素的化学信号传递人细胞内。ER位于细胞核内，是一种雌激素依赖性的转录因子，活化的ER以二聚体形式与靶基因启动子区的雌激素应答元件(estrogen response elements,ERE)高亲和力的结合，调控靶基因·的表达[}9}}ER也能通过其他转录因子间接发挥作用，产生生物效应.如转录因子激活蛋白1(Activating protein 1,AP-1)和刺激蛋白1(stimulating protein 1,SP-1)等。使用Matlnspector软件(http://www.genomatix.de/products/MatInspecto r/index.html)分析，在A DA M9基因的启动子区一311位点存在一个ERE，在一1183位点存在一个AP-1结合位点，在一287，-416，-428，-505，-519和一765位点存在6个SP-1结合位点。17β-雌二醇与ER形成的激素一受体复合物，在细胞核内与A DAMS启动子区的位点结合后增加了ADAM9的表达，因此17β-雌二醇是上调ADAM9表达的激活剂17β-雌二醇能够引起ADAM9启动子表达水平的上调，但这种表达水平的改变对其活性的影响如何，能否引起A日生成减少，尚需进一步证实。在HeLa细胞中没有发现雌激素对ADA_yl9表达的影响，究其原因可能是HeLa细胞缺乏内源性的ER.雌激素替代治疗能够延缓并降低女性发生AD的危险性，开始应用雌激素的时间与其治疗效果相关，绝经早期为有效的治疗时间窗日，但雌激素对生殖系统的致癌性限制了其临床应用选择性雌激素受体调节药物具有高度的组织特异性，既能发挥神经保护作用，又能减少对其他组织的副作用，是一种选择性和安全性强的药物[f}zJ。本课题组在今后的工作中将继续阐明这类化合物是怎样通过雌激素受体a和雌激素受体日启动基因的激活和抑制机制，进而发挥临床作用.

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