Fmr1基因敲除小鼠脑组织神经调节蛋白1表达的改变及其意义

脆性X综合征(FXS)是一种常见的遗传性智力低下性疾病，除不同程度的智能低下外，FXS临床还可表现为癫痛、活动过度、注意力障碍、孤独症、特殊面容和大覃丸等。该病由脆性X智力低下基因(Fmrl)5’端非编码区(CGG)n三核昔酸重复序列不稳定扩增及其相邻部位CpG岛异常甲基化，导致其编码的产物脆性X智力低下蛋白(fragile X mental retardation protein,FMRP)表达减少或缺失引起。已证实FMRP是一种mRNA结合蛋白，可能通过调控与神经发育和突触可塑性相关的mRNA翻译而发挥功能[2]。有研究表明，神经调节蛋白1(NRG 1)亦在神经元发育、突触功能及可塑性、神经递质的传递、以及}}r_甲基D一天冬氨酸的调节、Y_氨基丁酸A型受体以及乙酞胆碱受体亚基的表达中起着至关重要的作用[3]本研究通过观察不同年龄组Fmrl基因剔除(KO)小鼠和野生}J CWT)小鼠脑组织中NRG 1的分布和表达变化，探讨其在FXS患者发病机制中的作用

材料与方法

一、实验动物

FVB近交系Fmr1 KO小鼠和WT小鼠由荷兰伊拉斯塔斯大学细胞生物学及遗传学研究中心Oostra教授惠赠。1921℃自然光条件下饲养小鼠，自由获取食物和水分。随机选取出生后2周、4周雄性KO小鼠(KOZ"',KO约作为实验组，并以同龄的雄性WT小鼠(WT},WT4")作正常对照组实验前剪取尾巴组织提取DNA，按照B akker等介绍的PCR技术进行小鼠基因型鉴定。

二、免疫组织化学染色检测NRG 1阳性神经细胞的表达

分别取KOZ",KO"'小鼠及WTZ"',WT4"'小鼠各6只。水合氯醛腹腔注射麻醉后，经左心室快速灌注生理盐水至肝脏变白，再以40g/L多聚甲醛灌注，待小鼠头颈僵硬后断头取脑，置于4 0C,40 g/L的多聚甲醛一磷酸盐缓冲液固定24 h，然后相继放人15%,30%蔗糖溶液(用40 g/L多聚甲醛磷酸盐缓冲液及蔗糖配置)进行脱水，冠状位冰冻切片(厚度30},m)，按照即用型免疫组化超敏SP试剂盒(中国福州迈新生物技术公司)说明书操作:将切片用PBS(pH 7.4)冲洗3次，每次5 min，每张切片加人50},L过氧化酶阻断剂(A液)，室温孵育30 min;PBS洗3次，每次5 min，每张切片加人50},L正常非特异血清((B液)，室温孵育1h去除血清，然后每片加人50},L兔抗NRG 1一抗(美国PTG公司，浓度1:1000),4℃冰箱孵育过夜;37℃复温1 h,PBS洗3次.每次Smin，每片加人50},L生物素标记的羊抗兔二抗(C液)，室温孵育45 min;PBS洗3次，每次5 min，每片加人50},L链霉素抗生物素一过氧化物酶溶液(D液)，室温孵育30 min;PBS洗3次，每次5 min，每片加人50 u}L新配的DAB显色液.在显微镜下观察显色结果;2 min后用PBS洗3次，每次5 min;将脑切片贴于明胶处理过的载玻片上，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片二对未加一抗的阴性对照标本，用同样方法严格同步完成染色采用捷达801形态学图像分析系统进行图像采集，每只小鼠检测3张切片，所检测部位为大脑皮层及海马CA1区、CA3、齿状回。在高倍镜(x120)下选取6个不重叠视野。应用工mage J软件计数大脑皮层、海马CAl区、CA3区、齿状回NRG 1阳性细胞数，取其平均数。

三、Western blotting检测皮层、海马组织中NRG1蛋白的表达

分别随机选取6只KOz"',K04w及WTZw\WTw小鼠以水合氯醛麻醉，快速分离小鼠皮层、海马组织，然后加人全细胞蛋白提取液，置冰上30 min，再以40C,17 000 xg离心30 min，收集上清液分装，-80℃冰箱贮存。按照BCA蛋白浓度试剂盒(南京凯基生物公司)说明步骤进行蛋白浓度测定:样品经聚丙烯酞胺凝胶电泳。转膜后的PVDF膜用TTBS洗3次。5%脱脂奶粉溶液封闭1h，加人兔抗NRG 1一抗(美国PTG公司，1:1000),(3-actin(美国Santa Cruz公司，1:2000)，室温孵育2h，加人辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG(美国Santa Cruz公司，1:2000)，室温孵育1 h,室温下将膜置于发光液孵育，X线胶片曝光显影。结果应用Quantity One软件(美国B IO-RAD公司)读取各样本的NRG 1及对应的卜actin的吸光度似)值，以同一样本的NRG 1与卜actin的比值为该样本NRG 1表达的相对水平。

四、统汁学处理采用SPSS17.0统计软件进行数据分析，计量资料采用均数士标准差(x士、)表示，组间差异的比较采用两祥本t检验。P<0.05为差异有统计学意义一、

结果

一、WT与KO小鼠NRG 1阳性细胞数的比较

NRG1染色主要定位在细胞质上，在细胞质染色呈颗粒状，聚集成团。KO'-"',K040'小鼠大脑皮质、海马CAI和CA3区NRG1阳性细胞的数量较同龄的WTZ",WT4".小鼠明显减少，差异有统计学意义(P<0.05)，而KOZ"',K04"'小鼠齿状回上的NRG 1阳性细胞的数量较同龄的WT2}},WT'小鼠相比明显增多，差异有统计学意义(P<0.05)o(图1，表1)

二、WT和KO小鼠大脑皮层、海马组织NRG 1蛋白表达的比较

Western blotting结果,}T NRG 1有两条条带，相对分子质量分别为72 000和55 000。它们代表NRG1的不同亚型。KOz`"和K04"小鼠大脑皮层中相对分子质量为55 000的NRG1含量分别较WTZ`",WT“小鼠减少，差异有统计学意义((t=3.785,P=0.004;t=4.216,X0.002)，而相对分子质量为72 000的NRG 1含量与WTz"',WT4w小鼠比较差异无统计学意义(t=3.146,1'=O.OlO;t==3.248,E 0.090)}KOz"-和K04"'小鼠海马中相对分子质量为55 000的NRG1含量分别较同龄的WT小鼠减少，差异有统计学意义(t=5.415,}0.OOO;t=6.782,E 0.000)，而相刘一分子量为72 000的NRG1含量与WTz}}\WT4w小鼠比较差异无统计学意义(t=2.015,X0.072;t=3.105，P=0.061)o(图2-4)

讨论

随着对NRG 1功能研究的深人，NRG1与疾病的关系日益受到关注。NRG 1作为精神分裂症的易感基因已被证实[}5},NRG 1(}EGF)+/一和NRG 1(}TM卜/一小鼠在旷场实验和可变Y迷宫实验中均表现出了过度活跃等精神分裂样症状[6]，这些表现也见于Fmrl基因KO小鼠.但NRG 1与FXS的相关研究目前尚少见报道。本研究结果发现2周龄,4周龄Fmrl基因剔除小鼠皮层及海马中NRGl阳性神经元的数量和相对分子质量为55 000的NRG 1表达量均较明显减少，提不NRG1降低参与了FXS的发病机制。而相对分子质量为72 000的NRG 1表达量差异却没有统计学意义，这也许是因为不同的NRG 1亚型在脑组织中的作用不同所致[3]。由于NRGl参与中间神经元早期分化以及迁移的过程0故认为NRG 1减少可能引起神经环路中抑制性中间神经元的障碍和脑功能异常。本课题组前期研究也发现2周龄和4周龄FXS模型小鼠皮质和海马CA1,CA3区微白蛋白中arvalbumin,PV)阳性神经元的数量和PV表达量均较正常小鼠明显减少LHJ，与本研究中Fmrl基因KO小鼠皮层及海马NRG 1阳性神经元的数量和NRG1表达量减少的时间点基本吻合。Lei等在PV-ErbB4-/-(ErbB4即成红血球细胞的白血病病毒致癌基因同系物4)小鼠中证实，NRG 1还可以通过激活PV阳性神经元上NRG 1受体促使PV阳性神经元y_氨基丁酸的释放，从而参与皮层锥体神经元电活动的调节。NRG 1缺乏可使得中间神经元抑制功能的进一步降低，突触后锥体神经元兴奋性增高。对FXS小鼠而言，2周龄、4周龄也是癫痈易感性增高的年龄，但是否与该时期NRG1阳性神经元数量和NRG 1表达的减少相关需要证实。最近Tan等已发现边缘系统的痈性发作上调了NRG1-ErbB4信号，他们认为这可能是NRG1一ErbB4信号作为一个关键的内源性的负反馈机制参与了抑制边缘系统癫病的发生。本课题组前期在FXS模型小鼠上发现海马PV阳性神经元数量有区域分布差别，而Fmrl基因剔除小鼠齿状回PV阳性神经元数量没有变化。本研究发现Fmrl基因剔除小鼠海马齿状回NRG 1阳性细胞数较CA七CA3区减少，而比同龄WT小鼠明显增多。上述研究结果中NRG1与PV阳性神经元在数量、时空分布上的一致性，提示NRG 1减少与PV阳性神经元发育障碍可能有相关性。由于目前尚未见FMRP在海马CA 1,CA3区和齿状回表达的差异沪基因剔除小鼠齿状回NRG 1增多推测为代偿性的，其机制和意义有待进一步明确。

综上所述，笔者等认为NRG 1下调导致PV阳性神经元的结构和功能异常可能是Fmrl基因KO小鼠癫痈易感的原因之一，但这需要更多更深人的研究证实.

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