嘌呤霉素敏感的氨肽酶对β-淀粉样蛋白诱导的细胞凋亡的影响

AD是老年痴呆最常见的类型，其特征性的病理学改变是神经元细胞内神经纤维缠结(neurofibrillary tangles,NFT)、细胞外老年斑或神经炎性斑(senile plaque,SP)的形成及神经细胞的过度凋亡。NFT主要由Tau蛋白异常的过度磷酸化所致;SP主要是由卜淀粉样肚甲-amyloid peptide,A(3)沉积所致，并进一步引起神经细胞凋亡

研究发现漂吟霉素敏感的氨肤酶(puromycin-sensitive aminopeptidase，PSA)可降解异常的沉积蛋白Tau，增加运动神经元数量，减轻AD的症状〔3-5]，提示PSA可能成为一种新型的具有神经保护作用的氨肤酶，并进一步成为一种潜在的AD治疗药物。本研究通过在SH-SYSY细胞内沉默PSA表达、在PC12细胞内过表达PSA的基础上，加人Azs-ss诱导细胞凋亡，研究PSA对A(3引起的神经细胞凋亡的影响，进一步探讨PS.A作为一种潜在的AD治疗药物的分子机制，并为PSA的临床应用研究打下基础。

材料与方法

一、细胞培养

SH-SYSY为人神经母细胞瘤细胞株，PC12细胞为(褐家鼠)肾上腺嗜铬细胞瘤(一种交感神经系统的肿瘤)。SH-SYSY细胞培养于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、l 00 U/mL链霉素的DMEM高糖培养基中，于37 0C,5%COz、饱和湿度下培养，取对数生长期细胞进行实验;PC12细胞培养于含10%胎牛血清、5%马血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素的DMEM高糖培养基中，于37 0C,5%CO},饱和湿度下培养，取对数生长期细胞进行实验。

二、PSA质粒的提取与鉴定

PSA重组质粒由美国加州大学Karsten教授惠赠将PSA重组质粒转化JM109感受态菌，在具有Amp抗性培养板中37℃温箱培养过夜。挑单克隆加人含Amp的LB液体培养基中，置37℃摇床过夜培养。次H采用质粒提取试剂盒提取质粒。Ee old I和Xho I双酶切质粒，琼脂糖凝胶电泳鉴定片段大小，并将该质粒送北京六合华大基因科技股份有限公司进行基因测序。

三、主要试剂

DMEM高糖培养基购自赛默飞世尔生物化学制品(北京)有限公司;胎牛血清购自美国Gibco公司;质粒提取试剂盒购自美国OMEGA公司;脂质体转染试剂购自美国Invitrogen公司;A日?S_35}Hoechst33342购于美国Sigma公司;Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒购自南京凯基生物技术有限公司;caspase-3活性检测试剂盒购自美国Biovision公司;多克隆山羊抗PSA抗体购自美国Santa Cruz公司，多克隆兔抗caspase-3抗体购自美国CST公司;多克隆兔抗件actin抗体、HRP标记的兔抗山羊IgG,HRP标记的山羊抗兔IgG购自北京中杉金桥生物技术公司;SDS裂解液购自江苏碧云天生物技术研究所;针对PSA的siRNA序列5'-GUCCCACACAGACUUCUAUTT-3’，5’-AUAGA AGUCUGUGUGGGACTT-3’;5’-GUGCAUCUGUC AUCCGAAUTT-3’，5’-AUUCGGAUGACAGAUGC AC丁T-3’;5'-CCCUAGUACUCUGCAAACATT-3’，5'-UGUUUGCAGAGUACUAGGGTT-3’由吉玛公司设计并合成，使用工作浓度为20},mol/L

四、MTT法检测细胞增殖情况

取对数生长期的细胞接种于96孔培养板，SH-SYSY细胞5000个/孔，PC12细胞2000个/孔。在37 0C,5%CO:条件下培养过夜后分成4组，分别给予不同浓度(0,10,20,30},mol/L)的AN25-35处理，每组设5个平行孔。培养24 h或48 h后，每孔加人5 g/L MTT 20},L，继续培养4h后弃上清，每孔力l人DMSO 150},L，待甲攒完全溶解后，用酶标仪在波长490 nm处读取A ay0值。设对照组((0},mol/L的A压5-3:处理组)细胞存活率为100%，按公式计算其他组细胞存活率:细胞存活率(%)二实验组A a9。值/对照组A 49。值x1OO%0

五、Hoechst 33342染色检测细胞核形态

取对数生长期的SH-SYSY细胞、PC12细胞接种于6孔培养板中过夜，用不同浓度(0,10,20,30},mol/L)的A日2535处理24 h后，每孔加人Hoechst 33342(5 mg/L)1 mL,37 0C避光染色20 min，荧光倒置显微镜下观察、拍照。

六、细胞转染及A日2535诱导细胞凋亡

待SH-SYSY细胞进人对数生长期，以2.5x105/孔接种于6孔板中，在37 0C,5%C02、饱和湿度下培养。当细胞融合度约为50%时进行PSA-siRNA的转染，转染步骤参照脂质体说明书进行操作。PC12细胞以5x10'/孔接种于6孔板中，在37 0C,5%C02、饱和湿度下培养。当细胞融合度约80%时进行PsA质粒DNA的转染，转染步骤参照脂质体说明书进行操作。转染24 h后，加20},mol/L的AN25-35处理细胞。SH-SYSY细胞分组为:NC组，NC+A(3zs-s:组，PSA-siRNA组，PSA-siRNA+A(3}_35组;PC12细胞分组为:空质粒转染组，空质粒+A}25-35组，PSA过表达组，PSA过表达+A陇5-35组(以下七、八、九段实验均按此分组)。

七、Annexin V/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡率

按照上述分组处理细胞24 h后，用不含EDTA的胰酶消化收集各组细胞，PBS洗涤2次，2000 r/minx5 min离心，收集1x10'个细胞，重悬于500},L的Binding Buffer中，加5},L Annexin V-FITC,5},L PI，混匀后室温避光反应15 min，流式细胞仪(FCM)分析细胞凋亡率八、Western blotting检测细胞中P SA,caspase-3的表达按照六的方法分组处理细胞24 h后，用预冷的PBS洗细胞2次，SDS裂解液冰上裂解10 min,12000 r/minx5 min离心，取上清。经BsA法蛋白定量后，12%十二烷基磺酸钠一聚丙烯酞胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白质。电泳结束后将蛋白转移到用甲醇处理过的PVDF膜上，然后加人50 g/L脱脂奶粉室温封闭2h，加人稀释的一抗币-actin,1:1000稀释;PSA,1:1000稀释;caspase-3,1:1000稀释)4 0C过夜孵育，次日洗膜、加二抗(HRP标记的兔抗山羊IgG,HRP标记的山羊抗兔IgG,1:2000稀释)室温孵育、洗膜，最后加显色液在化学发光成像系统中成像。

九、Caspase-3活性检测

按照六的方法分组处理细胞24 h后，消化并收集(1}5)x 1 O6细胞，加人50},L预冷的caspase-3活性检测试剂盒自带细胞裂解液，冰上裂解10 min;10 000 r/minxl min离心，取上清;蛋白定量后每组各取100},g的蛋白用细胞裂解液稀释至50},L;每组样品加人50},L 2x反应缓冲液(含10 mmol/L DTT);加人5},L 4 mmol/L DEVD-pNA底物，37 0C孵育2h;用酶标仪在波长405 nm处读取A值。十、统计学处理采用SPSS13.0统计软件进行方差分析及组间比较，数据以均数士标准差表示，多组之间的比较用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，以P<0.05示差异有统计学意义。

结果

一、pCMV6-XL6-PSA质粒的鉴定结果

酶切鉴定使用EcoR I和xho I两种限制性内切酶}EcoR I位于多克隆位点，Xho I位于PS}基因的2101 by位置，载体上无此限制性位点，所以酶切得到2100 by和6700 by两条片段的克隆为PSA插人方向正确的克隆，结果如图1所示。基因测序结果进一步证实，pCMV6-XL6真核表达载体上的PSA的序列正确。

二、Ap25-35对SH-SYSY和PC12细胞活力的影响采用MTT法检测A N25-35对一SH-SYSY和PC 12细胞活力的影响。10,20,30},mol/L的AN2535处理SH-SYSY细胞、PC12细胞24 h或48 h后，分别都与相同条件下0},mol/L组A}zs-3s相比，结果显示细胞生长明显受抑制，差异有统计学意义((P}0.05)}(表1)

三、A25-35诱导SH-SYSY,PC12细胞凋亡的形态学检测AN25-3:诱导细胞后，Hoechst33342染色细胞核呈蓝色荧光，正常对照组细胞核边缘清晰，均质染色。加人不同浓度AN2535后，细胞核边缘不规则，染色质浓集边缘化，伴有核固缩、核碎裂并出现大小不等的凋亡小体(图210四、FCM检测PSA对A氏5-3。诱导的SH-SYSY,PC12细胞凋亡的影响采用Annexin V/PI双染FCM检测。结果见表2和表3，在SH-SYSY细胞中，NC+A陇}-35组凋亡率明显高于NC组，差异有统计学意义(P}0.05};在PC 12细胞中，空质粒+A}25-3:组凋亡率明显高于空质粒转染组，差异有统计学意义(P<0.05)，可见A(325-35能诱导SH-SYSY,PC12细胞出现凋亡。在SH-SYSY细胞中，PSA-siRNA组凋亡率与NC组比较明显升高，差异有统计学意义(P<0.05);而在PC12细胞中PSA过表达组与空质粒转染组凋亡率比较差异无统计学意义(P>0.05)，说明可能PSA本身具有神经保护作用，PSA缺乏也会诱导细胞出现凋亡。同时在SH-SYSY细胞中PSA-siRNA+A(3v_3:组凋亡率比NC+A(325-35组凋亡率升高，差异有统计学意义(P<0.05);fit在PC12细胞中PSA+A(32a_;;组凋亡率比空质粒+AN25-3:组凋亡率降低，差异有统计学意义(P<0.05)，进一步说明了PSA具有神经保护作用，PSA对A陇_-;5引起的神经细胞凋亡具有显著的抑制作用。

五、Western blotting法检测PSA和caspase-3蛋白的表达

PSA和caspase-3蛋白的表达见图3}细胞中PSA的表达情况见图3B，与NC SH-SYSY组相比.PSA-siRNA组PSA的干扰效果显著与P SA-siRNA+A队s_;:组比较，PSA;NC+A氏s-}s组的干扰效果显著，差异有统计学意义(P<0.05)}SH-SYSY细胞中casp ase-3的表达情况见图3C，加人A日2535后，与NC组比较，NC+A陇:-35组及PSA-siRNA+A(3z5_3;组caspase-3活性形式占总量的百分率都增多，并且_未加AN J-35仅干扰PSA表达((PSA-siRNA组)与NC组比较，caspase-3活性形式占总量的百分率也增多，差异有统计学意义(P<0.05)。而在PC12细胞中，PSA的表达见图3E，与空质粒组相比，PSA组PSA的过表达效果显著，差异有统计学意义(P<0.05);加A队-3s的两组比较(即空质粒+A(3二一3s组与PSA+A}}5-35组比较)PSA的过表达效果也显著，差异有统计学意义(P<0.05)o PC12细胞casp ase-3的表达情况如图3C，加人A}?5-35后，空质粒+A险5-35组与空质粒组比较。caspase-3活性形式占总量的百分率都增多，而PSA+A队5-35组与空质粒+A}}_3s组相比，caspase-3活性形式占总量的百分率减少，差异有统计学意义(P<0.05)o

六、Caspase-3活性检测

用A aos值反应caspase-3活性的量(图}>。结果显示力[I人A}zsas 24 h后，NC+A}izs3,组与NC对照组相比差异有统计学意义(P<0.05);空质粒+ANzs-3}组与空质粒组比较差异有统计学意义(P<0.05)o Caspase-3活性均增强，表明A}2}-3s引起的神经细胞凋亡机制可能为激活caspase通路。PSA-S1RNA组比NC组caspase-3活性增强，PSA-siRNA+A(3z5_3。组比NC+A(3zs-}s组caspase-3活性增强，且差异均有统计学意义(P<0.05)，说明PSA的沉默和A}zs-ss对细胞凋亡的诱导具有叠加作用而PSA组与空质粒对照组相比，caspase-3活性未见明显差异;同时PSA+A(32;3s组与空质粒+AN25-35组相比caspase-3的活性减少，说明过表达PSA在一定程度上能抑制A俘2s-3:引起的caspase-3活性的增加，这与Western blotting检测caspase-3蛋白的表达结果一致。

讨论

Ap沉积和Tau蛋白异常过度磷酸化作为老年斑和神经纤维缠结形成的主要原因，在AD的发病机制中起着重要的作用，二者共同引起神经元的凋亡。A日引起毒性的主要部位在第25-35氨基酸之间(A}2535}，可以引起机体氧化应激反应、激活神经细胞凋亡因子、启动细胞凋亡的级联式反应过程咚9〕本实验结果显示，A25-35能抑制SH-SYSY,PC12细胞增殖;经A日?5-35诱导的细胞，hoechst染色后发现细胞核边缘不规则，核染色质浓集、边缘化等细胞凋亡的形态学改变，流式检测细胞凋亡率增加，并且caspase-3活性增强。caspase属半恍氨酸蛋白酶家族，在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用，其中caspase-3是凋亡信号通路中一个重要的蛋白酶，也是凋亡的关键执行分子。Caspase-3正常以酶原(34 000)的形式存在于胞浆中，没有活性。在凋亡的早期阶段，它被激活;活化的casp ase-3由两个大亚基(19 000)和两个小亚基(17 000)组成，裂解相应的胞浆、胞核底物，最终导致细胞凋亡，因此常以活性形式的量占总量(包括casp ase-3酶原形式和活性形式)的百分率来衡量凋亡严重程度。这一部分说明A陇5-35能诱导神经细胞发生凋亡，并且提示AN25-35引起的神经细胞凋亡机制可能是凋亡信号激活caspase级联式反应所致。PSA是一种广泛分布的金属氨肚酶，在脑中含量很丰富。

Constam等研究发现PSA具有蛋白水解作用，在有丝分裂期与纺锤体微管的形成有关，并且PSA的抑制剂能引起细胞的凋亡。此外PSA对于细胞信号转导、蛋白质转运、MHCI的处理、细胞周期调节、胚胎发育都有重要作用。但以PSA对Tau蛋白的作用的研究是最为突出的:Karsten等[3]利用基因芯片技术和动物实验发现PSA可以降解AD中的沉积蛋白Tau;而且在果蝇实验中，发现抑制PSA的活性可以加剧神经退行性的病理改变。尽管人们早就知道PSA在脑组织中的含量丰富，但这是人们第一次提出PSA可以降解或修正AD中的Tau蛋白沉积Sengupta等从大肠杆菌中提取了人的PSA重组蛋白，体外加入金属离子、特异性或非特异性的蛋白酶抑制剂和Tau蛋白质底物，结果发现:PSA能够消化基因重组的人全长Tau蛋白，并且PSA的活性可以被嚷吟霉素所以抑制。从而得出结论:PSA可以在体外直接降解Tau蛋白，在预防Tau引起神经推行性疾病中发挥重要作用。为了继续研究PSA在哺乳动物体内的作用，Karsten课题组建立了PSA,TauP301L(AD小鼠模型)以及TauP301L-PSA的转基因鼠模型PSA的活性在PSA转基因鼠中比对照组高出2-3倍，没有观察到任何毒副作用;双转基因鼠TauP301L-PSA比单转基因鼠TauP301L较晚出现瘫痪症状，运动神经元数量明显增多，并且在脊髓、脑干、皮层、海马、小脑等部位显著降低了Tau蛋白的总量以及磷酸化Tau蛋白的数量[4]。

此研究表明，在哺乳动物体内，提高PSA的活性可以显著降低磷酸化Tau蛋白的沉积，减慢AD病情的发展。进一步的体外研究表明，在SH-SYSY细胞中过表达PSA时会下调正常Tau蛋白在细胞内的数量;反之当用PSA-siRNA干扰PSA表达时，检测到Tau蛋白的数量明显增多[4]，说明PSA可以对正常Tau蛋白含量进行生理性调节。研究表明PSA可以在体内及体外降解Tau蛋白，并能改善AD的症状，为以Tau蛋白为靶标治疗AD提供了新思路—Tau蛋白降解剂}}},,s}。作为AD病理学改变之一的Ap沉积，与Tau蛋白异常过度磷酸化密切相关，但是A(3与PSA之间的关系很少有人研究。本实验结果显示，在SH-SYSY细胞中沉默PSA的表达能使AN25-35诱导的细胞凋亡率升高，促进caspase-3酶原激活，其活性形式表达增多，同时检测到caspase-3活性升高，这说明在SH-SYSY细胞中沉默PSA的表达能促进AN2"-35诱导的细胞凋亡。相反，在PC12,细胞中过表达PSA能使AN253:诱导的细胞凋亡率下降，casp ase-3酶原激活受到抑制，其活性表达形式减少，同时检测到caspase-3活性下降，提示PSA在PC12细胞中过表达后抑制了A队-3}诱导的细胞凋亡。而且，在SH-SYSY细胞中仅沉默PsA的表达，并不用A}25-35诱导细胞时也出现了细胞的凋亡现象，即casp ase-3活性的升高，此作用与A队5-3:诱导的细胞凋亡具有叠加作用(图4A中的P SA-siRNA+A日2535组)。说明在正常细胞内PSA本身就具有保护神经细胞、抑制其凋亡的作用，此结论可与Towne等[14]在PSA基因敲除的小鼠中表现的神经系统功能异常的表现相联系，其具体机制有待进一步研究。总之，本实验结果揭示了PSA在正常细胞及AN2535诱导的细胞中都具有抑制神经细胞凋亡的作用，并且推测这种机制可能与其抑制caspase-3通路的激活有关。

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