线粒体分裂抑制剂在大鼠脑缺血再灌注损伤中的保护作用及其机制

细胞凋亡是导致脑缺血再灌注损伤的重要因素。线粒体在细胞凋亡中发挥着重要的作用[[1-2〕研究发现，细胞凋亡过程中均伴有线粒体不同程度的片段化，线粒体分裂与细胞凋亡关系密切[[3]。动力相关蛋白(dynamin-related protein 1,Drpl)是线粒体分裂的必需蛋白，通过抑制Drp 1可以抑制线粒体分裂，从而减轻心肌缺血再灌注损伤后的细胞凋亡叫。线粒体分裂抑制剂(mitochondrial division inhibitor,Mdivi-1)是近年发现的一种喳哇酮类衍生物，通过抑制GTP酶的活性选择性抑制Drp 1的表达，从而减轻线粒体分裂同。然而目前国内外关于线粒体分裂在脑缺血再灌注损伤中的作用鲜有报道，具体机制亦尚未阐述。因此，本实验拟对脑缺血再灌注损伤模型经尾静脉注射Mdivi-1，通过检测细胞色素C(Cyt C)蛋白及mRNA的表达变化，初步探讨Mdivi-1对脑缺血再灌注损伤的保护作用及其机制。

材料与方法

一、实验动物与分组

健康雄性成年Wistar大鼠60只，体质量250--300 g，由青岛市实验动物和动物实验中心提供。按随机数字表法分为假手术组、模型组和Mdivi-1预处理组，每组各20只。Mdivi-1预处理组于脑缺血前15 min预先尾静脉注射给予Mdivi-1(1.2 mg/kg),模型组同步给予等容量二甲基亚}J}I,(DMSO)每组再分为2个亚组，一亚组应用TUNEL法检测神经细胞凋亡情况及采用免疫组化染色法测定Cyt C阳性细胞表达水平，另一亚组应用Western blotting和RT-PCR检测Cyt C蛋白及mRNA表达水平。本研究实验动物的应用及实验程序得到青岛大学医学院实验动物应用管理委员会同意。

二、实验试剂

Mdivi-1(Cat No.M0199)购自美国Sigma公司，小鼠抗大鼠Cyt C单克隆抗体((Cat No.Ab13575)购自美国Abcam公司，辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG二抗、小鼠超敏二步法免疫组化检测试剂盒及DAB显色试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司.PCR引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，Trizol RNA提取试剂盒购自美国Invitrogen公司，PrimeScript RT-PCR Kit(Cat No DRR014A)购自日本宝生物工程(大连)有限公司，TUNEL细胞凋亡检测试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司。

三、实验方法

1.模型制作:大鼠术前禁食12 h,10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)腹腔注射麻醉，采用Longa法制备大鼠大脑中动脉闭塞局部脑缺血模型，线栓插人深度为(20士0.5)mm。脑缺血2h后将线栓拔出进行再灌注24 h}假手术组大鼠只行麻醉和血管分离术，不行缺血冉灌注及静脉注射。实验过程中大鼠用白炽灯照射，保持肛温3637℃以大鼠苏醒后出现左侧Homer征、爬行向右侧划圈或右前肢屈曲为造模成功的标志，剔除死亡和发生蛛网膜下腔出血的大鼠，随机补充人组。

2.神经细胞凋亡及Cyt C阳性细胞检测:脑缺血再灌注24 h后，应用10%中性甲醛(40%甲醛100 mL,0.01 mol/L pH7.4磷酸盐缓冲液900 mL配制而成)经心脏灌注固定，快速断头取脑，4%多聚甲醛固定2h，于视交叉吻侧和尾侧横断，取中段标本，常规脱水、透明、石蜡包埋、冠状切片，切片厚度6 mm,脱蜡至水。TUNEL法检测神经细胞凋亡，免疫组化染色SABC法检测Cyt C阳性细胞表达，均按试剂盒说明书操作，DAB呈色。每张切片在40x10倍视野下随机选取梗死周边区不重叠的57个视野，计数TUNEL阳性细胞数(胞核呈棕黄色颗粒)和细胞总数，以神经细胞凋亡率表示细胞凋亡情况;计数各视野中Cyt C阳性细胞数(胞质呈棕色，颗粒感，也有部分胞质、胞核均着色)和细胞总数，计算阳性细胞率，以反映Cyt C的表达水平。

3.Western blotting检测Cyt C蛋白表达:脑缺血再灌注24 h后，大鼠经10%水合氯醛腹腔麻醉，迅速断头取脑，取缺血再灌注侧同一位置的脑组织100 mg加人裂解液匀浆，冰上静置2h后12 000 r/min 4℃离心10 min，取上清液置于一80℃保存，BCA法测定蛋白浓度。配制质量浓度为15%的聚丙烯酞胺分离胶和5%的浓缩胶、蛋白上样量为50 I}g。电泳完毕将蛋自转至PVDF膜,7%脱脂奶粉溶液室温封闭2h，加人小鼠抗大鼠Cyt C(1:600)4 0C孵育过夜，次日洗膜后加人辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG二抗(1:6000)37℃反应1h，经化学发光法曝光后观察结果。以GAPDH作为内参，采用吸光度值扫描分析软件Quantiscan 1.0测定每条带的吸光度值。将相对吸光度值作为统计学分析的原始数据，以便去除蛋白不均衡降解造成的误差。

4.RT-PCR法检测Cyt C mRNA表达:取lOC mg待测脑组织，按照Trizol RNA提取试剂盒说明提取总RNA，测定RNA浓度。采用Prime Scripl RT-PCR Kit试剂盒，按操作说明进行逆转录合成cDNA，以逆转录所得的cDNA为模板进行PCR扩增。Cyt C引物:上游:5'-AGGCTGCTGGATTCTCT TACA-3'，下游:5'-GCCCTTTCTCCCTTCTTCTTA-3'，扩增产物长度151 by;GAPDH引物:上游:5'-AACGACCCCTTCATTGAC-3'，下游:5'-TCCAC GACATACTCAGCA-3'，扩增产物长度191 bp}PCR反应条件:95℃预变性5 min;98℃变性10 s,5 8 0C退火30 s,72 0C延伸40 s，循环35次后72 0C再延伸10 min0 PCR产物在含澳化乙咤的2%琼脂糖凝胶上电泳，紫外透射仪观察照相。用吸光度值扫描分析软件Quantiscan 1.0测定每条带的吸光度值。以GAPDH为内参照，通过Cyt C/GAPDH的吸光度值比值做相对定量分析。四、统计学处理采用spsslg.o统计学软件进行分析。计量资料以均数士标准差(x士、)表示，组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LsD-，检验。以p<o.os为差异有统计学意义。

结果

一、神经细胞凋亡检测结果TUNEL凋亡阳性神经细胞主要分布于梗死灶周围的纹状体及额顶部皮质，呈圆形或椭圆形，胞体缩小，核膜皱缩，染色不均、浓集于核膜附近、胞核呈棕褐色，可见核固缩和核碎裂。假手术组神经细胞凋亡数目少，模型组较假手术组明显增多，Mdivi-1预处理组较模型组明显减少，差异均有统计学意义(P<0.05)(表1，图1)

二、免疫组化染色结果Cyt C免疫组化染色阳性细胞主要分布于缺血周边区，即半暗带内，缺血中心区内较少表达。结果显示，假手术组仅少量细胞有阳性表达;模型组阳性细胞表达数目较假手术组明显增多，差异有统计学意义(P<0.05);Mdivi-1预处理组阳性细胞表达数目较模型组明显减少，差异有统计学意义(P<0.05)(表1，图2)只、Western blot及RT-PCR结果Western blotting及RT-PCR结果显示，模型组Cyt C蛋白及mRNA的表达比假手术组显著升高，差异有统计学意义((P<0.05);Mdivi-1预处理组Cyt C蛋白及mRNA表达比模型组显著降低，差异有统计学意义((P<0.05)(表1，图3,4)

讨论

脑缺血再灌注损伤后细胞死亡包括细胞坏死和凋亡两种形式，而脑缺血再灌注迟发性损伤则以细胞凋亡为主[f61凋亡是一种受基因调控的自主性程序性细胞死亡，也是脑缺血再灌注损伤中的主要环节日。关于细胞凋亡的研究发现，线粒体在细胞凋亡过程中起着重要的作用。近年来研究发现在多种细胞凋亡模型中存在线粒体的片段化，线粒体数量显著增加，证实线粒体分裂参与细胞凋亡过程。尤其在神经细胞凋亡中发现，线粒体有明显的形态改变，并且在神经细胞线粒体上检测到线粒体分裂蛋白，证实其与神经元退行性疾病有密切关联研究发现线粒体分裂受多种因素的调控，特别是Dlp1，其在调控线粒体分裂过程中发挥着重要作用[ll]。Dry 1是线粒体分裂的必需蛋自，其过度表达可促进线粒体分裂以及Cyt C的释放，通过上调Drp1K38A的表达来抑制Drp 1的作用，可以抑制线粒体的片段化、延迟Cyt C的释放、线粒体膜电位的下降和核DNA的片段化等凋亡表现日21。Ori等研究表明，在缺血前15 min采用静脉注射Mdivi-1(1.2 mg/kg)可明显减轻心肌缺血再灌注损伤。Brooks等研究发现，Mdivi-1也可以减轻肾小管细胞凋亡，从而减轻急性肾损伤。但是，迄今为止，关于线粒体分裂在脑缺血再灌注损伤中的研究国内外鲜有报道，即研究Mdivi-1在脑缺血再灌注损伤线粒体凋亡过程中的作用及其相关机制有着重要意义。

本实验通过脑缺血2h再灌注24 h大鼠大脑中动脉阻塞模型并应用Mdivi-1预处理，探讨Mdivi-1在脑缺血再灌注损伤中的作用，结果证实，应用Mdivi-1预处理，脑缺血再灌注损伤大鼠神经细胞凋亡率降低，表明Mdivi-1可抑制缺血再灌注损伤脑组织的细胞凋亡，然后进一步分别应用免疫组化染色、Western blotting及R丁一PCR检测Cyt C阳性细胞表达、蛋白及mRNA表达的变化，初步探讨Mdivi-1在缺血再灌注脑组织损伤中起保护作用的机制一近年来大量研究发现，Cyt C从线粒体释放到细胞浆是多种细胞凋亡的共同表现。Cyt C是线粒体介导的细胞凋亡途径中不可缺少的重要因子，在凋亡过程中起着关键作用。目前对Cyt C的研究也逐渐从其对能量代谢的调节转向对细胞凋亡的诱导方面生理状态下，Cyt C是一个定位于线粒体膜间隙的水溶性蛋白质，稳定性地结合于线粒体内膜，不能通过外膜。

在神经细胞凋亡过程中，Cyt C通过线粒体外膜释放，在ATP/dATP的参与下，在胞质中与Apaf-1结合形成寡聚体通过其氨基端和caspase-9前体的功能前区相互作用，导致caspase-3激活，并进一步激活下游的caspases，引起DNA的断裂，导致细胞凋亡。本研究证实，应用Mdivi-1预处理，脑缺血再灌注损伤后Cyt C阳性细胞率下降，蛋白及mRNA的表达明显减少，即Mdivi-1预处理使得缺血脑组织线粒体释放Cyt C明显减少，细胞凋亡率显著下降，从而抑制细胞凋亡综上所述，Mdivi-1可以减轻脑缺血再灌注脑组织的细胞凋亡，有望成为脑保护治疗的新靶点，其十预处理可能成为治疗脑缺血再灌注损伤的新方法。同时本研究初步表明Mdivi-1在缺血再灌注脑组织损伤中起保护作用的机制是通过阻断线粒体/Cyt C途径来减轻脑缺血再灌注脑组织的细胞凋亡，但其具体的作用机制仍有待下一步重点研究。