内质网应激在大鼠脑缺血再灌注损伤中的作用研究

内质网是细胞加工蛋白质和贮存Caz+的主要场所，其功能紊乱时出现错误折叠与未折叠蛋白在内质网腔内聚集以及CaZ十平衡紊乱的状态，称为内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)。研究发现，细胞在短暂性脑缺血时的变化与神经元内质网Caz+稳态受到破坏后的改变相同，都出现了ERS，显示内质网Caz+稳态紊乱参与了缺血性脑损伤的病理生理过程，ERS可能是脑缺血时细胞损伤的关键环节。过强的或长时间的ERS会引起ERS相关性凋亡。ERS相关性凋亡近年来受到广泛关注，而在ERS引起的凋亡过程中涉及到的凋亡相关蛋白更是研究的热点。其中，生长停滞及DNA损伤诱导基因153(growth arrest and DNA damage inducible gene 153,GADD153)是ERS诱导蛋白，参与ERS相关性凋亡;caspase-12是内质网的固有蛋白，与ERS诱导的细胞凋亡的执行功能有关[3],二者均属于ERS过程中的凋亡相关蛋白。本研究通过Western blottine,免疫组化染色及免疫荧光双标染色，观察大鼠大脑中动脉缺血再灌注损伤不同时间点二者在脑组织中的表达变化，以初步探讨ERS及其凋亡相关蛋白在脑缺血再灌注损伤中不同时间的作用。

材料与方法

一、材料

1.动物及分组:健康清洁级成年雄性Wistar大鼠42只，体质量240270 g，由山东大学医学院动物实验中心提供，实验动物设施许可证:鲁动质200010030 42只大鼠分为脑缺血再灌注损伤组36只、假手术组3只、正常对照组3只。根据随机排列表法将36只脑缺血再灌注损伤组大鼠按再灌注时间点分为4个亚组，即缺血2h再灌注6玩12瓦24 h,72 h组，每亚组各9只。

2.试剂:GADD153兔多克隆抗体、caspase-12山羊多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司。驴抗兔IgG-Dylight 549,驴抗山羊IgG-Dylight 488购自美国Jackson Immuno Research公司。兔IgG、山羊IgG即用型SABC试剂盒购目武汉博士德公司。辣根过氧化物酶藕联兔抗山羊IgG、山羊抗兔IgG由北京中杉金桥生物技术有限公司进口分装。小鼠来源多克隆抗体卜actin购自美国Chemicon公司。

二、方法

1.建模:采用改良Longa线栓法制备大鼠局灶性大脑中动脉缺血再灌注损伤模型[4]。大鼠用1O%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉。固定后，颈部正中切口，分离左侧颈总动脉(CCA)、颈内动脉((ICA)及颈外动脉((ECA)。结扎ECA的远端，用微动脉夹分别夹住ICA的远端和CCA的近端。在ECA上剪一小口，将头端涂以硅胶、直径0.25 mm左右的钓鱼线由切口处插人，由ECA经CCA至IC A，向上深人20~左右，在切口远心端将线栓与ECA结扎固定，逐层缝合皮肤。线栓成功2h后，用乙醚快速麻醉，拆开缝线(1}2针)，轻柔拔出线栓约15 mm,在结扎线附近剪断，让血流再通制成再灌注模型。假手术组插入线栓10 mm，余制作方法同上。正常对照组不做任何处理。术中室温保持在2030 0C，术后维持大鼠肛温约(37士0.5)0C。模型制作后用Longa神经功能评分标准判断是否成功，评分为0分与4分的动物弃之不用并另选动物补充人组。

2.灌注及取材:制模成功的36只大鼠分别于再灌注6 h,12 h,24 h,72 h给予10%水合氯醛(400 mg/kg)腹腔注射麻醉，0.9%NaCl左心耳灌注。假手术组于手术后2h、正常对照组于分组后进行麻醉、灌注。用于Western blotting检测的大鼠取左侧大脑半球视交叉至垂体柄之间的脑组织，迅速置于液氮中快速冷冻，然后放人一70℃冰箱中保存待测。用于免疫组化染色及免疫荧光双标染色检测的大鼠分别予0.9%NaCI灌注、多聚甲醛灌注后，取左侧大脑半球视交叉至垂体柄之间的脑组织。

3免疫组化染色检测GADD153及caspase-12的表达:大鼠脑组织常规石蜡包埋、切片，参照武汉博士德公司即用型SABC试剂盒说明书，按其操作步骤进行免疫组化染色。光镜下观察，以细胞浆及(或)胞核染成棕褐色为阳性细胞。每只大鼠取皮质区、纹状体区5张切片观测，每张切片取随机10个视野(x40)，计算阳性细胞率(阳性细胞数/计数细胞总数)x 100%}。每组大鼠脑组织阳性细胞数总数/每组大鼠只数一每组大鼠阳性细胞均值，并由此计算标准差。

4.免疫荧光双标染色检测GADD 153及caspase-12共表达:大鼠脑组织置于30%蔗糖溶液中沉底后，切片，厚约40}m，置于冷冻保存液中，-20℃冰箱中存放。用漂片法作GADD 153及caspase-12免疫荧光双标染色。驴血清室温下封闭30 min,PBS冲洗，加兔多克隆GADD 153抗体(1:150)及山羊多克隆caspase-12抗体(1:150),4℃过夜，PBS冲洗，加驴抗兔IgG-Dylight 549(1:200)及驴抗山羊IgG-Dylight 488(1:200),37 0C避光孵育免疫荧光显微镜下观察并照相。GADD 153阳性细胞发红色荧光，caspase-12阳性细胞发绿色荧光，双标阳性细胞发黄色荧光。每只大鼠取皮质区、纹状体区5张切片观测，每张切片取随机10个视野(x 40)，计数双标阳性细胞数，取平均值(计算方法同上)

5.Western blotting检测GADD 153及caspase-12的表达:提取蛋白并测定浓度;每孔加人80 p,g总蛋白进行电泳，转膜封闭后加人山羊抗GADD 153多克隆抗体或兔抗caspase-12多克隆抗体(1:500),37 0C反应1 h,TBS冲洗，分别加人辣根过氧化物酶藕联兔抗山羊IgG或山羊抗兔IgG(l:1000),37℃反应1h，加人DAB显色剂采用SigmaScan program 4图像分析软件(美国Systat Software公司)进行分析，以GADD 153或caspase-12平均吸光度值与阶actin平均吸光度值的比值反映GADD 153或caspase-12的表达水平。三、统计学处理统计分析采用SPSS13.0软件。计量数据以均数士标准差(;e士、)表示，多组间比较采用单因素方差分析(ANOVA}，组内两两比较采用LSD-c检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

结果

一、GADD 153及caspase-12免疫组化染色结果正常对照组及假手术组大鼠脑组织中GADD 153及caspase-12表达均为阴性。脑缺血再灌注损伤组再灌注6一72 h神经元及神经胶质细胞免疫反应增强，胞核及胞浆可见棕褐色颗粒沉积。阳性细胞计数分析显示二者的表达随时间呈现动态改变:再灌注6h可见GADD 153阳性细胞，再灌注24 h阳性细胞数较6h增多，至72 h达高峰，与再灌注6h组比较差异有统计学意义((P}0.05);再灌注6h可见caspase-12阳性细胞，阳性细胞数至24 h达高峰，72 h仍维持在较高水平，与再灌注6h组比较差异均有统计学意义(}PG0.05)0(图1,2)

二、GADDl 53及caspase-12免疫荧光双标染色结果正常对照组及假手术组大鼠脑组织中GADD 15 3及caspase-12单标细胞均为阴性。脑缺血再灌注损伤组再灌注6h可见GADD 153及caspase-12单标阳性细胞，并可见少量双标阳性细胞;12h二者单标及双标阳性细胞数均明显增多，至24 h双标阳性细胞数达到峰值，与再灌注6h组比较双标阳性细胞数差异均有统计学意义((P<0.05);72 h caspase-12单标阳性细胞数减少，GADD153单标阳性细胞数仍较多，双标阳性细胞数减少，与再灌注6h组比较差异无统计学意义((P>0.05)(图3,4)

三、GADD153及caspase-12Western blotting结果

Western blotting结果显示正常对照组及假手术组大鼠脑组织中GADD 153及caspase-12表达均为阴性。脑缺血再灌注损伤组再灌注6h可见GADD153表达，其表达水平逐渐增高，持续至72 h仍有较多表达，与再灌注6h组比较差异均有统计学意义((P<0.05)。脑缺血再灌注损伤组再灌注6h可见caspase-12表达.12h表达水平升高，至24 h达高峰，72 h时仍维持在较高水平，与再灌注6h组比较差异均有统计学意义((P<0.05)(图5,6)

讨论

GADD153即C/EBP同源蛋白(C/EB P homologous protein,CHOP)，是细胞应激相关蛋白，也是种转录因子，属于C/EBP家族成员，对细胞增生及分化具有十分重要的作用。GADD 153存在于细胞浆内，与ERS反应直接相它通过ERS的激活转录因子(activating transcription factor,ATF升4途径诱导表达，活化后转位至细胞核。GADD153是联系ERS与细胞凋亡的重要中间信号分子，它可以通过影响细胞内CaZ一代谢以及下调Bcl-2表达等多种途径促进细胞凋亡Caspase-12是调节ERS介导细胞凋亡的另一个主要因素，其在小鼠组织中广泛存在，在肌肉、肝脏和肾脏中高表达，但目前还未在人体找到easpase-12的对应物。Caspase-12位于内质网的胞浆面，可以被过度的ERS活化，这些应激包括内质网Caz+平衡的破坏及内质网过多的蛋白沉积等，而非ERS介导的凋亡过程无Caspase-12活化[9]。因此，caspase-12是ERS介导的细胞调亡所固有的。caspase-12以肿瘤坏死激活因子与前体caspase-12复合物的形式特异性地存在于内质网表面，该复合物在ERS发生时解体，caspase-12从内质网释出，进一步激活caspase级联反应，导致细胞凋亡本研究通过免疫组化染色和Western blotting检测观察到GADD I 53及caspase-12随时间改变呈现出不同的变化规律:脑缺血再灌注6h，缺血区脑组织GADD153及caspase-12表达均明显增高，casp ase-12增加更明显，GADD 153持续至72 h仍明显增高，而caspase-12至24 h达高峰，72 h略有下降。这与Shibata等报道的caspase-12的变化结果一致。可见，GADD153和caspase-12参与了脑缺血再灌注损伤的病理过程，二者的改变随时间呈动态变化。

本研究结果说明ERS参与了脑缺血再灌注损伤的病理过程，可能起到促进神经元及神经胶质细胞凋亡的作用二本研究免疫荧光双标染色结果显示，冉灌注6h GADD 153较caspase-12阳性细胞数增加明显，可见双标阳性细胞;12 h,24 h GADD153和caspase-12阳性细胞数均明显增加，双标阳性细胞数较多;72 h caspase-12单标阳性细胞数减少，GADD 153仍较多，但双标阳性细胞数减少。这提示在再灌注损伤早期(6 h),caspase-12活化可能占主导地位，激活了各种凋亡因子;随着再灌注损伤加重(1224 h),GADD 153被大量激活，GADDl 53与caspase-12共同作用，促进了ERS的进展，加速了细胞凋亡的级联反应;随着抗凋亡机制的启动(72 h),caspase-12活化略下降，GADD153的活化可能占主导。由此可见，当ERS发生时GADD 153及caspase-12通过不同的途径被激活，活化后二者通过不同途径促进细胞凋亡级联反应，1224 h双标阳性细胞数较多说明二者可能在此环节相互影响，而其具体机制还有待于进一步研究加以阐明。

参考文献

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