脑出血后血红蛋白对血脑屏障的影响

脑出血(ICH)是一类发病率、致死率、致残率都很高的脑血管疾病，我国每年发病率约为(60}80)/I 0万[y，约占我国全部脑卒中的20%}-30%，其30 d内死亡率可高达40%}50%}z}ICH后脑水肿的发生、发展是导致ICH患者神经功能严重缺损、脑病甚至死亡的主要原因。作为维持中枢神经系统内环境稳定的重要结构，血脑屏障(blood-brain barrier,BBB)的结构和功能障碍是导致ICH后血管源性脑水肿发生、发展的主要原因。在兔的ICH模型中，ICH后24 h即可见血红蛋白(hemoglobin,Hb)在血肿周围脑组织中的释放[3}}Bao等0向大鼠脑内注射Hb 24 h后，观察发现脑组织含水量有明显的增加。这些研究提示ICH后早期即有Hb在血肿周围的释放和蓄积，且Hb可能参与了ICH后脑水肿的发生、发展过程。然而，目前关于Hb导致ICH后脑水肿的分子机制鲜有报道。本研究通过向大鼠脑内注人Hb，检测不同时间点BBB功能和分子结构的改变，探讨Hb在ICH后脑水肿发生、发展过程中的作用

材料与方法

一、试剂和仪器Hb}美国Sigma公司),RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒(美国Therm。公司)，荧光定量PCR试剂(加拿大Fermentas公司)，鼠抗claudin-5,Z0-1抗体及红色荧光标记的驴抗鼠二抗(美国Invitrogen公司)，伊文氏蓝(日本和光纯药工业株式会社)。大鼠立体定向仪(美国Narishige公司)，光学显微镜、荧光显微镜及成像系统(德国Leica公司)，多功能酶标仪(美国Molecular Devices公司)，荧光定量PCR仪(美国ABI公司)。

二、动物分组及模型制作SPF级SD成年雄性大鼠108只(体质量280300 g)，由广东省医学实验动物中心提供。按随机数字表法分为正常对照组(12只),Hb组(48只)和假手术组(48只);再进一步依据模型制作完成后观察时间点的不同，将Hb组和假手术组分为6 h,24玩3 d,7 d共4个亚组(每个亚组12只)将大鼠以36目L水合氯醛腹腔注射麻醉后固定于立体定向头架。中线右旁3 mm处做一长度约1 cm左右的纵行切口，暴露颅骨及前自。于前肉前1 mm、中线右旁3 mm，用牙科钻钻一直径约1 mm的圆孔。用微量注射器沿钻孔方向垂直进针，深度为6 mm,Hb组缓慢匀速推注20},L Hb溶液(150 g/L)，假手术组大鼠在相同位置注人等量生理盐水，正常对照组不做任何处理。注射后留针l 0 min，缓慢退出注射器，骨蜡封闭骨孔，缝合皮肤切口。清醒后分笼喂养。

三、观察方法1.HE染色:在造模完成后相应的时间点，将各组大鼠用3 6 g/L水合氯醛腹腔注射麻醉;生理盐水心脏灌注后使用40 g/L多聚甲醛溶液灌注;将脑组织取出后行常规石蜡包埋、切片，HE染色。2铁染色:石蜡切片常规脱蜡水化后，参照文献[5]使用普鲁士蓝溶液(5%亚铁氰化钾溶液和5%盐酸按1:1混合)染色45 min;蒸馏水冲洗5次后滴加1%DAB显色液孵育15 min;0.03%Hz0:和0.5%DAB染色10 min后HE复染3.伊文氏蓝(evans blue.EB)检测BBB通透性:于处死前2h经股静脉注射2%EB(4 mL/kg)，生理盐水心脏灌注后断头取脑取损伤侧平面厚约5 mm的脑组织，切除皮层，秤量其湿重后，加人2 mL的50%三氯乙酸二37℃孵育72 h，研磨器充分研磨后20 000 xg离心20 min，取I mL上清与3 mL无水乙醇混合。应用多功能酶标仪在Ex 620 nm,Em 680 nm的条件下测定荧光强度，从标准曲线上查得EB含量，结果以N}g/g脑组织表示。4.免疫荧光检测紧密连接蛋白:石蜡切片常规脱蜡至水，置于Tris-EDTA缓冲液((PH 8.5)中微波加热20 min进行抗原修复，山羊血清室温封闭30 min，去血清后分别滴加claudin-5,Z0-1抗体，4 0C孵育过夜，PBS冲洗5 minx3次，滴加驴抗鼠荧光二抗，室温孵育1 h,PBS冲洗后甘油封片。荧光显微镜下观察并拍照，检测Hb灶附近微血管内皮细胞间紧密连接蛋白claudin-5和ZO-I的表达情况5.实时荧光定量RT-PCR检测claudin-5和ZO-1 mRNA:在造模后相应时间点，将大鼠麻醉后直接断头，取30 mg脑组织标本，按RNA提取试剂盒、反转录试剂盒说明书步骤提取总RNA，反转录合成cDNA}claudin-5,Z0-1和p-actin(内参)的引物由Invitxogen公司合成，序列如下:claudin-5:上游:5'-TGAGGACTTGACCGACCTTT-3’，下游:5'-AC TGTTAGCGGCAGTTTGGT-3’;ZO-1:上游:5'-GC TCACCAGGGTCAAAATGT-3'，下游:5'-GGCTTA AAGCTGGCAGTGTC-3';(3-actin:上游:5'-CCACC CGCGAGTACAACCTTCTT-3’，下游:5'-GAAGCC GGCCTTGCACATGCC-3'o PCR反应条件:95 0C 10 min,(95 0C 15 s,60 0C 1 min)x40个循环。通过标准曲线的相对定量方法检测claudin-5和ZO-1 mRNA的表达状况四、统计学处理所有数据采用SPSS 19.0统计软件处理。计量资料以均数士标准差(x1s)表示。2组间比较采用两样本t检验进行分析，以P<0.05示差异有统计学意义

结果

一、Hb注人大鼠脑内后病理变化Hb注人大鼠脑内后6 h,HE染色可见明显的水肿坏死带，表现为组织疏松，细胞变性、坏死，核固缩、碎裂，细胞水肿。24 h时水肿坏死进一步加重，3 d时有所缓解，至7d时水肿坏死带逐渐消失，可见少量残留的Hb，主要集中于血管周围:(图1)

二、Hb注人大鼠脑内后铁染色结果Hb组不同时间点的铁染色结果见图2}Hb注人大鼠脑内后第3天在Kb灶附近可见有少量铁离子释放，7d时铁离子释放增加，主要位于血管内皮细胞。Hb注人后6h和24 h未见明显铁离子释放

三、BBB通透性结果Hb组、假手术组和正常对照组的EB渗出量比较见图3。大鼠脑组织中EB渗出量的正常水平为(2.979士1.155)},g/g，假手术组在6 h,24 h,3 d和7d的EB渗出浓度分别为((4.656士0.524)协目g、(3.387土0.446)},g/g,(3.118士0.205)},g/g和(3.967士0.306)N}g/g>}组在6 h,24 h,3 d和7d的EB渗出浓度分别为(9.13211.607)},g/g,(8.834士2.725)},g/g,(10.931士3.793)},g/g和((6.66110.792)},g/g，明显高于正常对照组和假手术组相应时间点，差异有统计学意义(P<0.05)o

四、免疫荧光检测不同时间点的紧密连接蛋白Hb组大鼠不同时间点紧密连接蛋白claudin-5和ZO-1的表达比较分别见图东图5。正常时，BBB紧密连接蛋白claudin-5和ZO-I在血管内皮细胞间表达清晰，并呈连续条带状分布。Hb注人大鼠脑内后不同时间可见血管内皮细胞间claudin-5和ZO-1表达不连续，表达水平下降，显不BBB紧密连接有不同程度的结构破坏。

五、紧密连接蛋白claudin-5和ZO-1 mRNA相对表达结果分别以正常claudin-5和ZO-1 mRNf、表达量作为标准，各组大鼠脑组织claudin-5和ZO-1 mRNA相对表达量的比较见表1、表2。与假手术组相比，Hb注入大鼠脑内后6 h,24 h,3 d和7d claudin-5和ZO-1在mRNA水平均明显下降，差异有统计学意义(P<0.05)

讨论

ICH后，血管源性脑水肿是脑水肿的主要类型。脑水肿的发生、发展是ICH患者神经功能恶化甚至导致死亡的主要原因之一。ICH后，作为维持中枢神经系统独特内环境稳定的重要结构，BBB的结构和功能障碍是ICH后脑水肿发生、发展的主要病理基础。BBB由脑毛细血管内皮细胞及其间紧密连接、内皮基膜、周细胞与胶质细胞终足组成。其中，内皮细胞间紧密连接是维持BBB功能的关键结构。前期研究表明，大鼠脑内注入自体血后可引起紧密连接蛋白的表达降低，同时伴随BBB通透性的明显升高,ICH后，炎性因子、Hb分解产物、凝血酶、氧化应激、补体和基质金属蛋白酶等因素均可导致BBB的破坏f R7。然而，ICH后Hb对BBB功能和紧密连接分子结构的影响迄今鲜有报道。红细胞是血液中含量最多的血细胞，主要成分是由血红素和珠蛋白组成的Hb,ICH时，红细胞裂解，大量Hb释放进人周围脑组织，超过珠蛋白的结合能力，进一步分解产生血红素和珠蛋白在血红素加氧酶的作用下血红素分解产生大量游离铁离子、一氧化碳和胆绿素，胆绿素再迅速被胆绿素还原酶还原为胆红素。向大鼠脑内注人完整红细胞3d后出现了BBB通透性的增加和明显的脑水肿，而注人裂解的红细胞后发现，24 h内即有BBB通透性的显著增加和明显的脑水肿形成。这提示ICH后完整的红细胞不会引起脑水肿的发生，而红细胞崩解后释放的Hb可能参与了ICH后脑水肿的发生、发展过程。在兔的ICH模型中，24 h时在血肿周围脑组织中即可见Hb的释放[3]。当向大鼠脑内直接注入Hb会引起脑含水量的显著增加}4.ion。在豚鼠交换输血模型中，Hb可引起BBB紧密连接蛋白ZO-1表达下降和IgG渗出增加[mo。这些研究提示ICH后早期即有红细胞崩解和Hb的释放，且释放的Hb可能是导致BBB损伤的重要病理介质传统对Hb的研究主要集中于Hb的分解产物在IC H后脑水肿发生发展过程中的作用。W on等[n2}研究发现，蓄积的铁离子可介导产生大量自由基产物引起内皮细胞的变性、紧密连接蛋白occludin和ZO-I的减少，进而引起BBB的开放。

ICH后铁离子引起的氧化应激可通过影响水通道蛋白一4的表达而加重脑水肿[73]。大鼠脑内分别注入FeClz和Hb24h后均发现明显的神经元死亡，而使用去铁敏可以改善Hb引起的神经元死亡。目前研究认为Hb参与脑水肿的形成、神经元死亡等病理过程主要可能通过其降解产物铁离子来实现的。然而，Hb本身介导BBB破坏、参与脑水肿发生发展过程的分子机制仍不清楚。本研究发现，Hb注人大鼠脑内后在Hb灶周围有明显的水肿坏死带，第3天时在Hb灶周围才可见铁离子的少量释放，7d时Hb灶已大部吸收消失，残留的Hb主要集中于血管周围，而7d时蓄积的铁离子逐渐出现在血管内皮细胞上。EB渗出实验结果表明，BBB通透性在Hb注人大鼠脑内后有显著地升高，明显高于正常水平和假手术组。Hb注人大鼠脑内后6瓦24玩3d和7d，紧密连接蛋白claudin-5和ZO-1在mRNA水平表达明显下降。Qing等的研究发现，ICH后第7天铁离子蓄积达到高峰，而脑水肿高峰发生在ICH后第3天。这提示在ICH的早期，脑水肿的发生发展过程中可能有其他机制的参与Hb注人大鼠脑内后第3天和第7天，脑水肿的进展可能与铁离子在血管周围不断蓄积有关。

然而，在Hb注人大鼠脑内后6h和24 h即可见BBB结构和功能的破坏，这表明在铁离子释放之前，Hb本身即可引起BBB紧密连接蛋白claudin-5和ZO-1的表达下降，导致BBB通透性的增加，进而参与脑水肿的发生、发展过程。本研究通过向大鼠脑内直接注入Hb后发现，在铁离子释放之前Hb本身即可能引起BBB紧密连接蛋白claudin-5和ZO-1的表达下降、通透性增加，进而导致脑水肿的发生、发展。然而，Hb注人大鼠脑内后导致BBB结构和功能破坏的具体机制仍不清楚，需作更进一步深人地研究。这些问题的阐明将有助于深人理解Hb在ICH后脑水肿发生发展中的作用，为探索ICH的治疗措施提供新依据.

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