X线照射后体外培养星形胶质细胞VEGF和GFAP表达变化及意义

放射性脑损伤(radiation brain injury,RBI)是头颈部放疗后常见且严重的并发症之一，通常发生于放疗结束后3}6月或3年左右，常表现为认知功能障碍、癫痛等神经功能损害症状及体征，严重者可引起广泛脑水肿，甚至脑坏死RBI一日_发生，病程往往呈进行性不可逆性发展，缺乏有效的治疗方法。星形胶质细胞是放射治疗致神经系统损伤后最早出现反应的细胞之一，照射早期星形胶质细胞即可迅速由静息状态向活化状态转变，并产生众多细胞因子侧，激活的小胶质细胞对后继细胞辐射损伤可能有启动意义[4]。因此，星形胶质细胞的活化、增生始终贯穿于RBI的各个阶段，可能是RBI发生的重要环节。

胶质原纤维酸性蛋白(glial fibrillary acid protein,GFAP)是星形胶质细胞的一种肾架蛋白，它被公认为星形胶质细胞的特征性标记物，病理状态下可反应性上调，因此GFAP也可作为病理状态下星形胶质细胞的活化标志物，其表达的多少用来反映损伤后胶质细胞反应的严重程度，对脑损伤程度有直接影响。照射后早期即可发现星形胶质细胞被激活，表现为细胞数目增多，GFAP表达上调，病理上表现为胶质化增生，且胶质化增生的程度往往与脑损伤的严重程度密切相关网。

迄今为止，放射治疗后脑损伤的发生机制尚不清楚，血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)被认为是造成脑血管源性水肿的关键因素门，是放射后微血管损伤的主要促发因子[8]，有研究表明辐射后可观察到脑中VEGF表达阳性的星形胶质细胞浓集于血管通透性增加部位及血脑屏障破坏区域[9]。研究证明VEGF的过表达可以诱发异常畸形的新生血管形成，导致血管渗漏造成持续性的水肿阳。而最近国外多个临床试验证实，VEGF拮抗剂能使RBI患者水肿体积明显缩小。病情得到持续缓解[12-14]，进一步证实了VEGF与RBI的发生发展密切相关。由于VEGF拮抗剂用于RBI的治疗目前还仅限于临床试验，且其具体的治疗机制尚不明确，限制了其在临床上的应用。而星形胶质细胞作为脑损伤时VEGF分泌的主要来源细胞，了解它对电离辐射的反应及辐射后VEGF的表达变化对理解VEGF拮抗剂治疗RBI的机制至关重要因此本实验通过X射线照射体外培养的星形胶质细胞，观察其活化情况以及GFAP,VEGF的表达随照射剂量及照射时间的变化特点，探讨星形胶质细胞活化后VEGF的表达与脑组织放射损伤的关系，希望有助于深人了解RBI的发生发展机制，以期为临床上VEGF拮抗剂治疗RBI提供理论依据

材料与方法

一、实验动物出生1d内SD大鼠，雌雄不限，由中山大学北校区动物实验中心提供。

二、主要试剂及仪器

DMEM/F 12培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、双抗购自美国Gibco公司;小鼠抗大鼠GFAP单克隆抗体购自美国Cell Signaling Technology公司;兔抗大鼠VEGF多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司;DAPI染色液购于碧云天生物技术研究所;异硫氰酸荧光素(FITC)标记羊抗小鼠二抗、辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔二抗均购自北京康为世纪有限公司。CO:培养箱为美国Thereto公司产品，IX71型倒置荧光显微镜为日本Olympus公司产品。细胞辐照采用美国Varian公司23EX医用电子直线加速器。

三、星形胶质细胞的体外培养及鉴定取出生1d内SD乳鼠,75%乙醇浸泡，断头处死后取出大脑半球.在解剖显微镜下分离出大脑皮层，小心剥除脑膜及血管后放人预冷的D-Hank's平衡液，用显微剪充分剪碎后加人1.25 g/L胰酶约1}2 mL,37℃消化10 min后用含10%胎牛血清的DMEM/F 12培养基终止消化，离心5 min后弃_L清，取沉淀加人培养基重悬，吹打混匀制成单细胞悬液，调整细胞密度以1.Ox10}个/mL接种于25 cm2细胞培养瓶内，37 0C,5%CO:条件下培养，每隔2}3天换液1次。培养至细胞基本长满融合时将培养瓶放于水平恒温摇床以37 0C,13.07xg摇18h，换液弃去小胶质细胞和少突胶质细胞。将纯化所得的星形胶质细胞用2.5 g/L含EDTA的胰酶消化后以1:2接种于新培养瓶。传至3代后，将一部分细胞接种于6孔板内，待细胞贴壁铺满孔板后，免疫荧光染色检测GFAP进行星形胶质细胞的鉴定并计算纯度。纯度计算方法:在荧光显微镜下随机选5个不重叠视野，计算GFAP阳性细胞数占DAPI染核的总细胞数的比例，重复3次后取平均值传至3代后，细胞纯度大于95%，符合后续实验要求

四、照射条件与实验分组照射采用Varian直线加速器6 VIV X射线进行单次照射，吸收剂量率为4 Gy/min，吸收剂量为5,10,15,20 Gy，照射后48 h进行免疫荧光染色及GFAP,VEGF的表达测定等，20 Gy剂量组分别在照射后4玩12 h,24 h,48 h后检测相关指标，同时设立正常对照组，细胞保存于同样环境但不经X射线照射。

五、免疫荧光染色检测GFAP及细胞形态学观察将接种于6孔板的细胞用PBS洗涤后室温下以40 g/L多聚甲醛固定20 min,PB S洗3次后0.3 Triton X-100破膜15 min,PB S洗3次，山羊血清室温封闭1h，不洗，去除血清后加入小鼠抗大鼠GFAP单克隆抗体工作液(工作浓度1:300),4℃过夜，吸出一抗工作液，PBS洗后加人FITC标记的羊抗小鼠IgG(工作浓度1:50)反应1 h,DAPI复染5 min，荧光显微镜下观察细胞凋亡情况及GFAP染色。

六、DAPI染色观察各组星形胶质细胞的凋亡分别于规定时间点弃细胞培养液，PBS洗涤后40 g/L多聚甲醛固定10 min,PBS洗涤，DAPI染色5一10 min，立即用荧光显微镜观察，正常细胞核呈均匀蓝色荧光，凋亡细胞核染色后表现为核固缩或形成多个核碎片，通过细胞核形态改变计数正常细胞数和凋亡细胞数来说明各组细胞的凋亡情况。

七、Westerning blotting检测星形胶质细胞GFAP,VEGF蛋白的表达收集培养瓶中的各组细胞，并提取细胞总蛋白。BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。各组取总蛋白约30},g进行SDS-PAGE(12%分离胶)凝胶电泳后，转移到PVDF膜上，用含50 g/L脱脂奶粉的TBST缓冲液室温下封闭1h后分别加人小鼠抗大鼠GFAP单克隆抗体、兔抗大鼠VEGF多克隆抗体、小鼠抗大鼠GAPDH单克隆抗体(工作浓度分别为1:1000,1:500,1:4000)，室温摇床摇1h后4 0C杂交过夜。次日再次常温摇1h后洗膜，以后加人对应二抗(工作浓度1:5000)，室温孵育1h后用超敏ECL化学发光试剂盒显色，于暗室内压片，显影定影。所得条带运用Image J图像分析软件分析。

八、统计学方法

利用SPSS13.0软件进行统计学分析，计量资料以均数士标准差任士、)表示。组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LsD-t检验，以P<0.05为差异有统计学意义

结果

一、免疫荧光染色检测GFAP的表达观察星形胶质细胞的形态变化

免疫荧光染色结果显示，与正常对照组比较，5 Gy照射剂量组星形胶质细胞开始增生、细胞数增多，细胞变形，胞体肥大肿胀，分支增多，突起增粗，染色加深，且这种变化随照射剂量加大而表现得更明显。20 Gy剂量组从照射后4h即开始发生形态和数量上的改变，并随时间的延长变化更明显，至48 h时肥大细胞最多，胞浆内GFAP染色最深，提示X线照射后星形胶质细胞形态发生明显变化。(图1,图2)

二、DAPI染色观察各组星形胶质细胞的凋亡情况

DAPI染核表现为核固缩或形成多个核碎片者为凋亡细胞。正常对照组中可观察到少数细胞自然凋亡情况，5,10,15,20 Gy照射剂量组照射后48 h均可见少部分细胞出现凋亡，与正常对照组相比，各剂量照射组星形胶质细胞凋亡率差异均无统计学差异(P>0.05)，提示X线照射对星形胶质细胞的凋亡无影响。(图3,表1)

三、Western blotting检测各组星形胶质细胞GFAP蛋白的表达

Western blotting检测结果显T不同剂量组星形胶质细胞GFAP蛋白的表达不同.差异有统计学意义(F--40.067,I}0.00伪。进一步两两比较结果显示，与正常对照组相比，5,10,15,20吻照射剂量组GFAP蛋白表达均增高，差异有统计学意义(P<0.05)。随着照射剂量的增高GFAP蛋白表达亦增高，差异有统计学意义(P<0.05)。提示X线照射可明显上调星形胶质细胞中的GFAP蛋白表达，细胞活化。(图4，表2)

20 Gy剂量照射不同时间组GFAP蛋白表达差异有统计学意义(P<0.05);与正常对照组比较.20 Gy剂量照射后各时间点的GFAP蛋白均显著上调，差异有统计学意义(P<0.05)。随着照射时间的延长，GFAP的表达呈时间依赖性增高，各组之间差异均有统计学意义(P<0.05)。提示X线照射后GFAP蛋白表达增高与时间呈一定的依赖关系。(图5、表3)

四、Western blotting检测各组星形胶质细胞VEGF蛋白的表达Western blotting检测结果显示各剂量组星形胶质细胞的VEGF蛋白表达差异有统计学意义(F--12.539,P=0.000)。进一步两两比较结果显示，与正常对照组相比，不同剂量照射组VEGF蛋白的表达均显著增高，差异有统计学意义(P<0.05). VEGF蛋白的表达随着照射剂量的增高而增高，差异有统计学意义(P<0.05)。提示X线照射显著上调星形胶质细胞VEGF蛋白表达。(图6，表4)20 Gy剂量照射不同时间组VEGF蛋白表达差异有统计学意义(P<0.05);与正常对照组比较，20 Gy剂量照射后各时间点的VEGF蛋白均显著上调，差异有统计学意义(P<0.05)0 24 h达到高峰，至48 h后稍有下降，但仍显著高于正常对照组，差异有统计学意义(P<0.001)。提示X线照射后VEGF蛋白表达的增高与时间呈一定的依赖关系。(图7，表4)讨论微血管通透性增高和血脑屏障完整性的破坏是EZBI放射性血管源性脑水肿及脑坏死的主要病理生理基础，在高剂量放射后可一直存在并逐渐加重[15].其不论放射早期(数小时或数天)及晚期(数月以上)均可观察到[16-18]，但其机制至今仍未清楚:星形胶质细胞作为中枢神经系统中最多的一类细胞，其突起末端的脚板与内皮细胞一起共同构成血脑屏障，直接或间接的调节内皮细胞的紧密连接，诱导并维持血脑屏障的特性，与微血管系统有着密切联系，发挥着维持大脑微环境稳态的重要生理功能，与脑组织损伤后的病理过程及损伤后修复有着密切关系。研究星形胶质细胞在电离辐射损伤中的作用对于临床上EZBI的治疗有重要意义。许多的动物实验及外科手术病理均证实，胶质增生是星形胶质细胞对放射损伤的主要反应，GFAP是星形胶质细胞的标志性蛋白，它的表达程度可反映细胞的激活程度，也用于标记中枢神经系统损伤后胶质化反应程度。辐射损伤后胶质细胞数目增多，GFAP表达增强，且程度与照射剂量呈正相关[y7J。本实验中以X射线((4组剂量分别为5 Gy,10 Gy,15 Gy,20 Gy)照射体外培养的星形胶质细胞.48 h后检测GFAP表达，发现随着剂量的增加GFAP表达逐渐增高，呈剂量依赖性。

同时免疫荧光染色发现照射后星形胶质细胞形态学明显改变，细胞数量增多，胞体肿胀肥大，突起增多变粗，显色加深20 Gy单次照射后，分别继续培养4 h,12 h,24 h,48 h后检测GFAP表达，免疫荧光染色发现星形胶质细胞形态改变随时间推移变化愈加明显，GFAP染色显色加深，且GFAP表达呈时间依赖性增高。由此可见:体外培养的星形胶质细胞接受电离辐射后可直接被激活，形态学发生明显改变，细胞增殖明显，且增生活化的程度随照射剂量的增加和照射时间的延长呈依赖性加重。、VEGF是相对分子质量34 00045 000的糖蛋白，也称血管渗透因子，能促进内皮细胞囊泡小体活动.还可使内皮细胞间紧密连接蛋白磷酸化，表达降低从而增加血管通透性。另外，VEGF还是目前已知促血管生成作用最强的细胞因子，过高的VEGF水平诱导的新生血管多为渗漏性大的病理性血管，可造成大量渗漏性大、结构功能不完整的新生血管形成，当血管新生进程导致内皮细胞储备耗竭时，血脑屏障的急性大量破坏可最终引起脑水肿或坏死[fl}l多个实验研究发现，照射后出现放射性脑水肿前数周，总能观察到活化的星形胶质细胞增多，星形胶质细胞内VEGF mRNA表达增加，病灶周围VEGF水平上调。Naosuke等在对19例放射性脑坏死的患者切除的坏死脑组织进行组织病理学分析后发现VEGF阳性表达的星形胶质细胞浓集于坏死组织周边，可能是造成坏死周围水肿的主要原因。在胸腰段脊髓放疗后.VEGF减少的转基因小鼠与野生型小鼠及VEGF增加的转基因小鼠相比，经历了一个较长的中位时间后才表现出了无力及瘫痪[9]。最近有研究证实，抗VEGF治疗可以显著减轻RBI患者的脑水肿情况并能持续缓解病情[12-13]，提示VEGF可能是造成微血管损伤、放射性脑水肿形成的关键因素。

本研究以4组不同剂量X射线照射体外培养的星形胶质细胞，发现细胞中VEGF的表达量明显增加，具有剂量依赖性。同样在20 Gy剂量照射后于不同时间检测细胞中VEGF的表达，发现VEGF的表达量随时间的延长而明显增加，至24 h时达高峰，48 h稍有下降，但仍明显高于对照组。提示放射治疗后急性期VEGF表达升高，并随辐照剂量的增加和辐照时间的延长而逐步增高。Nordal等[9]的研究提示随着照射时间的延长，VEGF的表达逐步增高，与本实验结果稍有不同。48 h VEGF表达稍有下降考虑可能是由于在体外星形胶质细胞中VEGF表达增高后逐渐通过胞体的分泌作用释放至细胞培养液中造成，可收集各组细胞培养上清液采用ELLISA测定培养液中VEGF的含量来进一步确定X线照射后诱导星形胶质细胞活化、细胞增生肥大，GFAP表达明显增高，随着剂量加大和时间延长其影响愈加明显，同时星形胶质细胞中VEGF表达呈剂量、时间依赖性增高。提示GFAP与VEGF之间可能存在相互的交叉促进作用。星形胶质细胞内一些即早基因如肿瘤坏死因子((TNF-a),Cox-2,c-jun,c-fos等在照射后即刻就有表达}z,}，可以刺激星形胶质细胞的增生和肥大，其次放射线损伤导致的自由基产生会导致细胞变性，促发星形胶质细胞中GFAP mRNA表达增加，增生活化的星形胶质细胞产生更多的细胞因子，进一步促进细胞增殖。增殖中的细胞耗氧量是GO期细胞的3}5倍，从而就进一步造成缺氧，增生肥大的星形胶质细胞对缺氧发生反应，产生更多的缺氧诱发因子一1 a(hypoxia inducible factor-1 alpha,HIF-la)，其靶基因VEGF就进一步增高。VEGF表达增高后可通过星形胶质细胞突起末端的脚板传递给毛细血.管，从而促进血管再生，在一定程度上改善局部因放射导致的缺血状态，减少神经元损伤。

但是随着时间的延长或剂量的增加，VEGF的大量浓集可打破正常的血管生成通路，诱导异常新生血管形成{(zo.zz}。而异常新生血管所特有的成熟与重塑障碍可引起进一步的血管损伤和VEGF释放的恶性循环，最终造成血管通透性增加、血脑屏障破坏，放射性脑水肿形成。综上所述，X射线照射体外培养星形胶质细胞后可发生一系列病理生理变化，星形胶质细胞可被直接激活，反应性增生和肥大，GFAP表达增高，同时VEGF表达呈时间、剂量依赖性增高，可能是造成RBI的重要因素。理解星形胶质细胞接受X射线照射后这些因子的变化对于提高放射治疗效率同时减少正常脑组织的损伤有所启发。以后进一步的研究考虑建立放射性脑迟发性损伤的动物模型，延长观察时间，了解VEGF与其他血管生成因子直接的相互关系，借以了解放射治疗晚期VEGF及星形胶质细胞在RBI微血管重塑上的作用，为临床上抗VEGF治疗放射性脑迟发性损伤提供充分的理论依据

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