重叠延伸聚合酶链反应法克隆人REGⅠα基因

　　幽门螺杆菌(HelicobacterMLpyloriML,MLHp)是定植于人胃内的革兰阴性螺形杆菌，自Warren等首次分离以后，人们已从流行病学与动物实验学的角度分别证明了Hp感染与胃炎胃癌密切相关。RT-PCR以及免疫印迹试验(Western试验)表明，饰感染患者的胃组织内REG工。基因表达明显上调，且Hp感染的INS-GAS小鼠模型也发现了同样的现象。这一发现提示，REG工。基因可能在Hp感染促胃炎以及胃癌转化的病理过程中发挥着重要作用。　　为深人研究Hp感染引起胃炎和胃豁膜癌变机制以及寻找有效靶向的治疗方法，需要克隆出REGIa基因进行深人研究。REGIa基因在正常组织，如肌肉、肝脏内的表达量很低，或几乎不表达，故采用普通RT-PCR方法很难获得REGIa基因的cDNA克隆，本试验采用重叠延伸PCRML(MLOE-PCR)克隆人REGIa基因，为其生物学功能的研究提供基础。材料与方法一、实验材料正常人外周静脉血采自杭州市第一人民医院。　　菌株与质粒大肠埃希菌JM109为本实验室保存质粒pcDNAML3ML.1购自Invitrogen公司。该研究获得了浙江省医学科学院伦理委员会批准。主要试剂:DreamTaqMLDNAMLPolymerise购自Fer-mental公司，T4DNA连接酶、限制性内切酶XhoIML,BamHI购自NEB公司;凝胶回收试剂盒购自Axygen公司;引物由lnvitmgen公司合成;琼脂糖购自Biowest公司;DNA分子量标记物DL2000购自Takara公司。QiagenMLDNA提取试剂盒购自Qiagen公司。　　二、试验方法　　1.引物设计　　根据NCBI上GeneMLID:ML5967，登陆号为NM-002909.4的人REGMLIMLa基因cDNA序列，以及En-sembl上基因号ENSG00000115386，转录子编号EN-ST00000233735的外显子与内含子序列设计引物。ExonML2的前引物与ExonML6的后引物加人酶切位点，其他上下游引物分别与邻近的外显子序列有18个碱基的重合。引物序列见表1.　　2.扩增各外显子　　采用酚氯仿法从人全血中提取基因组DNA模板。操作步骤:(1)将1MLmL抗凝全血放人10MLmL离心管中，加入3MLmL的ddHzML0混匀，静置10MLmin后，4℃、3000MLr/m离心10MLmin，收集细胞沉淀。(2)沉淀中加人400MLuLMLSTE缓冲液[0.1MLmol/LMLNaCl,ML10MLmmol/LTris-Cl(pHML8.0)、1MLmmol/LMLEDTAML(MLpHML8ML.ML0ML)，10ML%MLSDS40MLp.L，蛋白酶-KML10ML}L(10MLmg/mL)，充分混匀，56℃水浴5MLh0(3)离心管内加人500ML}L的25:24酚:氯仿，颠倒混匀，13ML000MLr/m离心10MLmin0ML(4)取上清，加等量25:24酚:氯仿混匀，13ML000MLr/m离心10MLmin0(5)取上清，加2倍体积的无水乙醇，轻摇混匀，直到出现絮状沉淀，然后15ML000MLr/m离心3MLmin0(6)去上清，加人500匹70%乙醇洗涤，15ML000MLr/m离心3MLmin0ML(7)去上清，晾干后加人50MLpLMLddH2。溶解，备用。上述操作过程中使用的离心机离心半径为8.1MLcm0以人基因组DNA为模板，以各外显子引物对为引物，分别扩增REGIa基因外显子2一6。扩增反应体系((ML20ML}L)为:DNA模板1MLpL,MLML10\DreamMLTaqBufferML2MLuL，前引物(20MLmol/L)ML0.5ML、cL，后引物(20MLmol/L)0.5ML}L,MLDreamTaqMLDNAMLPolymeraseML0.2ML}cL,ddH20ML15.8ML}L。扩增反应条件均为:94℃预变性5MLmin;ML94℃45MLs,ML50ML0CML30MLs,ML72℃45MLs,ML30个循环;72℃延伸10MLmin。加人琼脂糖电泳分析分别胶回收各PCR反应产物，获得REGIa基因ExonML2一6。DNAMLnanoML2000微量紫外分光光度计检测各扩增产物浓度。　　3.外显子通过OE-PCR方法连接两个相邻外显子的PCR扩增产物等摩尔比混合后，52℃解链温度扩增10个循环，再向反应体系中加人引物对:前外显子的前引物(Forward)与后外显子的后引物(Reverse)ML50℃解链温度继续扩增30个循环。反应体系(50ML)如下:10MLxMLMLDreamMLMLTaqBufferMLML5MLPL，前引物(20MLmol/L)1MLPL，后引物(20MLmol/L)1MLML,MLDreamTaqMLDNAMLPolymeraseML0.5MLuL，两相邻外显子PCR产物等摩尔比混合物，适量ddH}ML0补足至50MLPLoMLPCR反应结束后，胶回收与预期片断条带大小相符的扩增条带，获得REGMLI。基因两个相邻外显子的连接产物(图1)MLoMLDNAMLnanoML2000微量紫外分光光度计检测扩增产物浓度。MLMLMLML4ML.ML.E-PCR方法扩增REGIa基因全长cDNA序列并构建克隆表达载体按照上述DE-PCR方法，将Exon2一6连接起来，胶回收获得500MLby连接产物，即REGMLI。基因全长cDNA}MLXhoI,MLBamHMLI限制性内切酶双酶切REGIa基因全长cDNA与pcDNA3ML.1载体。酶切产物采用PCR回收试剂盒回收后，T4连接酶16℃过夜连接后转化人JMML109感受态细胞内。利用pcDNA上携带的氨节青霉素抗性基因筛选出抗性菌株后做PCR及双酶切鉴定。鉴定正确的载体，送至Invitrogen公司进行测序。　　结果　　一、分别扩增获得REGIa基因ExonML2一6片断　　提取人基因组DNA后，分别以REGia基因ExonML2一6引物对为引物，扩增得到REGMLIMLa基因2一6的扩增产物见图2。长度分别为64MLbp,119MLbp,138MLbp,112MLby和68MLby，长度与表1预期设计的相匹配。　　二、OE-PCR连接REGIa基因的相邻外显子　　OE-PCR方法分别将Exon2与Exon3,Exon4,5,6连接起来，获得Exon2一3,Exon4一6MLDNA片断(图3ML)ML,MLExon2一3连接产物长度183MLbp,MLExon4-6连接产物318MLby，与预期相符。　　三、OE-PCR扩增REGIa基因全长cDNA序列　　OE-PCR方法将Exon2一3与Exon4一6连接起来，获得REG工。全长cDNA，长度为501MLby(图4)。　　四、REGIa真核表达载体构建　　图5可见，采用REGIa基因特异引物PCR与限制性双酶切的方法鉴定克隆，获得插人片断大小正确的REGMLIMLa真核表达载体。　　五、DNA测序法鉴定REGIa真核表达载体　　PCR与酶切鉴定正确的质粒，送至Invitrogen公司进行测序鉴定，测序结果表明REGIa基因cD-NA序列大小，插人位置和方向正确，与NCBI数据库中的REGMLMLIMLMLa基因相符(NM-002909ML.ML4，相符度100ML0Io，说明重组载体构建成功。　　讨论　　REGMLI。基因可能在饰感染促胃炎以及胃癌转化的病理过程中发挥着重要作用。REGIa在正常组织内表达量很低，通过RT-PCR方法很难获得cDNA克隆，故本研究采用OE-PCR技术分别扩增各外显子表达片断，然后逐一将各外显子片断通过互补的引物末端重叠连接在一起，通过几个连接一扩增的循环操作，最终获得REG工。全长cDNAoOE-PCR技术是针对待扩增的DNA碱基序列，设计具有互补末端的特异性引物，使扩增出的PCR产物具有重叠部分，随后通过PCR扩增反应，在重叠链的延伸中将具有互补末端的扩增片段连接起来。OE-PCR技术不需要内切酶的消化与连接酶的处理，可很快获得较难扩增的基因产物，其在基因的定点突变、融合基因的构建、长片段基因的合成等方面均有广泛而有效的应用，但该技术的难点在于引物的设计和PCR退火温度的选择「8-9MLI本文根据各外显子的序列设计特异性的引物，并遵循以下原则:前外显子的反向引物在与模版完全互补的末端之后延伸至少18个碱基，且这l8个碱基与后外显子的序列互补;后外显子的正向引物与模版互补的末端之前存在至少18个碱基，且这18个碱基与前外显子的序列互补，从而使前外显子与后外显子的扩增产物均带有相互重叠的豁性末端。　　带有豁性末端的外显子扩增产物，纯化后，按照一定的比例混合，经过PCR扩增反应，最终通过互补的勃性末端连接起来，且用于连接外显子的PCR扩增反应，其退火温度应该比外显子扩增反应的退火温度至少高2ML0C。本文结果表明该条件能获得较理想的基因片段。　　REGIa基因是一个单拷贝基因，位于2号染色体短臂1区2带和3带，含有6个外显子和5个内含子，REGIa基因全长3ML.ML0MLkbML,MLcDNA长度为SOIMLbp,l一6号外显子的长度分别为28,110,119,138,112,261MLbpoMLTATA盒和CCAAT，盒位于转录起始位点上游的27MLby和100MLby，信号肤和翻译起始位点}1T“位于2号外显子内。我们针对REGIa基因外显子及含有起始密码子和终止密码子的序列特点，分别设计特异的克隆引物，将基因分段扩增出来，且每段DNA序列的引物均含有重叠末端。再通过重叠末端的载连，将DNA片断逐次连接，拼接得到全长的REGMLIMLa基因cDNA序列。　　构建含REGIa基因cDNA的真核表达载体后，可进一步开展REGIa基因调控上皮细胞增殖的生物学机制研究，从而验证REG工。基因介导Hp感染相关的胃豁膜上皮细胞增殖，深人了解REGMLIMLa参与胃炎向胃癌发展的生理机制，为胃癌的预防与监测提供新思路。　　志谢感谢浙江省医学科学院贾振宇研究员在课题进行过程中提供的建议和帮助.　　参考文献　　Kim SS,Cho YS,Kim HK. 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