麻醉复苏期大鼠皮质脊髓束神经电信号特征差异实验研究

脊髓损伤时因皮质脊髓束(corticospinal tract,csT}受到损坏，损伤平面以下仍存活的脊髓神经细胞失去了大脑中枢的神经支配，因此随意性的运动功能受到不同程度的破坏。脑机接口技术(brain-machine interface,BMI)的研究为脊髓损伤后的轴突再生与功能重建开辟了全新的研究途径即将微电极芯片植人脊髓损伤处，采集中枢相应功能区发出的运动命令信号。解码分析后实时控制外接功能装置如机器臂等，实现重建机体功能，这将开创全新的脊髓损伤后运动功能恢复的治疗方法。

本课题组已通过在麻醉状态大鼠的脊髓内置人记录电极，稳定地采集并记录到较长时间、较为稳定的微伏级CST神经电信号，并使用先进的神经电信号分析软件对麻醉状态下CST神经电信号进行了放电频率、波形、波幅等多项指标的分析阔。然而麻醉与复苏状态大鼠CST自发放电在放电频率、波形、波幅等各方面是否存在差异鲜见报道。本研究观察大鼠经复合麻醉剂Chlorpent麻醉后麻醉及复苏过程中CST神经电信号放电频率、波幅、峰间期(ISI)等方面的变化，描述并分析麻醉及复苏期大鼠CST神经电信号的特征差异，以期为脊髓损伤修复与功能重建的进一步研究提供有意义的神经电生理基础性资料。

材料与方法

一、材料

1.仪器及试剂:记录微电极l阻抗(550士40)kS}],电极尖端直径5080},m;微电极推进器((Pf5-1型，日本光电公司);神经放电信号采集处理系统(Cerebus，美国联合科技公司);恒温冰冻切片机(CM1900-Cryostat型，德国Leica公司);正置显微镜(DMR型，德国Leica公司);0.1%勒克司坚牢蓝(美国Sigma公司);复合麻醉剂Chlorpent(每100 mL含水合氯醛4.25 g、硫酸镁2.12 g、戊巴比妥钠2.12 g、无水乙醇14.25 mL,l,2丙二醇33.80 mL、双蒸水51.95 mL).

2.实验动物:成年雄性SD大鼠，体质量240260 g，清洁级，由南通大学实验动物中心提供。

二、方法

1.动物手术:将大鼠称重，按0.2 mL/100 g体质量计量腹腔注射复合麻醉剂，待完全麻醉后卧姿固定四肢及头部，剪除背侧术区鼠毛，经0.5%碘伏液消毒，确定大鼠T7-8脊髓段，在T8棘突上下作背部正中切口，切口长约2-3 cm，依次切开皮肤及皮下组织，并剥离椎旁肌肉，用咬骨钳咬除T、棘突和全椎板至椎弓根部，咬除部分T7和T9椎板以扩大椎管，暴露硬脊膜(长约lcm)。沿正中线用显微镊轻轻挑开硬脊膜，使脊髓背侧暴露，随后将浸有温生理盐水的纱布覆盖在切口处。

2.电极定位:参照文献[2-3]的结果，将记录电极尖端定位在脊髓后正中沟偏右方向180200},m处上方。以10},m的推进间隔调节微电极推进器，逐渐将记录电极插人暴露的T:处脊髓内，电极尖端插人深度为680800},m。最后将参比电极置人离Tu处约1 cm的肌肉内，并在大鼠左侧或右侧大腿肌肉插人针灸针，用导线与记录仪的接地端连接作为动物接地。

3.CST神经电信号的采集记录:设置信号采集处理系统Cerebus的各项参数:采样窗口电信号幅度限定200600 O,V，采样频率30 kHz，采样窗口时长1.6 ms。前置放大器有效阑电位选择为一60}-80},V，放大倍数5000，低通滤波7.5 kHz，高通滤波250 Hz。边观察采样窗口扫描波形，边适当调整记录电极尖端深度，直至采样记录窗口出现的放电波形大于阂电位，利用采样记录软件可选择的色标，将多种记录波形以不同颜色加以区分，同时在记录窗口的各子窗口将不同的叠加波形分别显示。实时观察采样电信号的信噪比(signal noise ratio,SNR)大小，当SNR值大于2.5且较稳定后采集记录神经放电信号。以时间长度每200秒为一采集记录单位，按照系统设定的存储文件格式存档以作进一步离线分析。采用趾的刺激反射(趾蹼反射)和角膜反射判断大鼠麻醉及复苏状态}a}实验大鼠在麻醉后1h趾蹼反射和角膜反射均为阴性，麻醉后2h均出现趾蹼反射和角膜反射且随着时间推移反射强度渐增。分别在麻醉后1 h,2 h,3 h记录大鼠CST神经电信号，每次实验记录10 min:最后在电极下游剪断脊髓，观察采样窗口的波形变化，采样记录200 s。随后将电极上游脊髓剪断，观察采样窗口的波形变化，采样记录200s

4.神经电信号分析:采用信号分析处理软件Off-line Sorte:和Neuro Explorer分析存储的放电信号文件，比较在麻醉后1玩2 h,3 h大鼠CST神经电信号在放电频率、波幅、ISI等方面的差异。

5.确认电极尖端位置:采样记录结束后，经灌注、固定、取材及后固定、脱水后，把脊髓T8段按连续横切面行冰冻切片，而后进行勒克司坚牢蓝染色，用Leica正置显微镜采图，观察采样电极尖端插人的深度。

三、统计学处理实验数据用均数士标准差表示，采用SPSS 11.5统计软件进行常规统计，比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验尹<0.05为差异有统计学意义。

结果

一、长时间稳定记录到csT的自发放电勒克司坚牢蓝染色显示电极尖端位于csT内(图1)。当电极下游脊髓被剪断后，采样窗口显示的电信号波形与先前正常记录的无明显差别，因此所记录到的神经电信号来自于脊髓损伤上游中枢。当电极上游脊髓被剪断后，采样窗口只显示基线信号，先前的神经放电信号消失。

二、采集记录放电信号时的SNR分析

SNR分析显示，记录电极在麻醉后1 h,2 h,3 h均达到很高的SNR,SNR最大值为12.26，最小值为3.04}SNR>2时所记录的信号是较为理想的有效波形[5]，故本研究记录的CST自发放电信号是可靠的

三、麻醉复苏期大鼠CST自发放电信号特征差异比较

采用信号分析处理软件Off-line Sorter对麻醉后1 h,2 h,3 h的神经放电信号作脉冲扫描图和波形扫描图，结果显示麻醉状态下的大鼠CST自发放电呈阵发性发放，复苏状态下的大鼠CST自发放电呈弥散性发放。波幅随着麻醉后时间的增加而逐渐变小。(图么图3)

在每种状态单位时间内，选取7个典型放电波形进行波幅测量，结果显示麻醉后1,2h3 h CST自发放电波幅不同，差异有统计学意义(F--92.283,P=0.000)。麻醉后1h波幅[(640.13土126.01琳V〕大于麻醉后2 h,3 h[(200.44士19.53琳V、(144.49士22.52)},V]，差异有统计学意义(P<0.05).(图4)

运用神经信号分析软件Neuro Explorer分析发现麻醉后1 h(麻醉状态)大鼠的CST自发放电在单位时间内总数远小于麻醉后2 h,3 h(复苏状态)，即频率存在明显差异，麻醉后1h以串的形式呈有节律的阵发性发放(图SA)。随着麻醉后时间的增加，大鼠CST自发放电有越来越多的脉冲出现在串脉冲之外，渐呈弥散性发放(图SB,SC)，全时长的自发放电频率均大于麻醉状态。

麻醉状态的大鼠ISI值较为集中.不应期卞成分为0.02 s(图6A);复苏状态下ISI值较为分散，不应期值主成分大于0.02 s(图6B,6C).

讨论

对脊髓损伤患者的冶疗，一贯的治疗原则是在减轻继发性损伤的基础上促进脊髓再生修复与功能重建网。移植治疗和康复训练等方法对脊髓损伤患者的功能恢复具有一定的治疗效果0-8}。随着陈列式微电极技术的发展，BMI的相关研究如通过所谓的“意念取物”实现一定机体功能重建的报道也日益增多[f9_}o7。将微电极芯片直接植人脊髓损伤处，将大脑皮层相应功能区发出的运动命令信号与下行通路桥接，实现重建机体功能，这将是一个全新的实现运动功能恢复的治疗方法，也是未来研究的重点和方向[f}}l。本课题组的前期工作已在麻醉状态下的大鼠脊髓内稳定地采集记录到较长时间的微伏级神经放电信号，并对麻醉状态下的信号进行了放电频率、波形、波幅等多项指标的分析。为了探索麻醉状态与复苏状态下的大鼠CST自发放电在放电频率、波形、波幅等各方面是否存在差异，本实验采用复合麻醉剂Chlorpent对实验大鼠进行麻醉.并进行实验数据的分析。

本研究发现大鼠从麻醉后到逐渐清醒的过程中所采集记录到的神经放电信号在放电频率、波形、波幅等各方面存在明显差异。麻醉状态下的大鼠CST自发放电呈阵发性发放，复苏状态下的大鼠CST自发放电呈弥散性发放;波幅随着麻醉后时间的增加而逐渐变小;麻醉状态下的大鼠CST自发放电以串的形式呈有节律的阵发性发放，在单位时间内总数远小于复苏状态(即频率差异)。这一结果与文献报道的在感觉皮层所进行的实验结果一致.另外，笔者也选择使用水合氯醛和戊巴比妥钠分别进行麻醉后实验，尽管麻醉期和复苏期的时间点与复合麻醉剂Chlorpent存在差异，但一记录的CST电信号在麻醉状态与复苏状态下放电频率、波形、波幅的变化无特异性。本研究在麻醉及复苏状态下所记录的波形波幅尽管不同，但其基本特征与文献报道的在大脑皮层记录的放电信号相似f13-14]。非麻醉状态下CST内记录到的自发放电信号可以直观地反映脊髓与大脑的神经通路功能。通过植人电极记录脊髓自发电信号不会因开颅导致脑出血、脑水肿等，对实验对象创伤小，死亡率低，有利于动物的长期存活，检测结果可重复性高，非常适合一些慢性实验(如脊髓损伤、脑缺血再灌注)后功能恢复各时间点的观察。本研究利用神经信号分析软件对电信号进行分析发现麻醉状态与复苏状态下的大鼠CST自发放电在放电频率、波形、波幅等各方面存在差异，为通过在中枢尤其在脊髓植人阵列式微电极采集神经电信号的方法奠定了相关实验基础，为损伤脊髓功能修复的研究提供稳定、客观的良好评价指标，为脊髓损伤修复与功能重建的进一步研究提供了有意义的神经电生理基础性资料。

参考文献

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