选择性环氧合酶-2抑制剂对胃癌细胞Bgc-823增殖的影响

　　作者：韦璐1,令狐恩强2　　作者单位：1.南京医科大学第二附属医院消化科，江苏南京210011;2.中国人民解放军总医院消化科，北京100853

　　【摘要】目的探讨选择性环氧合酶-2(COX-2)抑制剂——美洛昔康、塞来昔布对胃癌细胞Bgc-823增殖与凋亡的影响。方法四唑盐比色实验法(MTT法)检测Bgc-823细胞的生长情况;流式细胞术检测细胞凋亡及细胞周期。结果美洛昔康、塞来昔布呈剂量和时间依赖性抑制Bgc-823细胞的增殖;塞来昔布的作用强于美洛昔康。塞来昔布可诱导Bgc-823细胞凋亡，将细胞阻滞在G0/G1期;随着药物浓度的增加，凋亡率增加，G0/G1期细胞比例增加。结论选择性COX-2抑制剂呈剂量和时间依赖性抑制胃癌细胞生长，这种作用可能依赖于对COX-2表达的抑制。选择性COX-2抑制剂呈剂量依赖性影响细胞周期，诱导胃癌细胞凋亡。

　　【关键词】 胃癌,环氧合酶-2,增殖;凋亡,细胞周期

　　Abstract： ObjectiveTo investigate the effect of selective cyclooxygenase-2 inhibitors (SCIs) meloxicam and celecoxib on the proliferation and apoptosis of human gastric carcinoma cell line Bgc-823. MethodsThe number of Bgc-823 cells was determined by MTT assay. Tumor apoptosis and cell cycle were studied by flow cytometry. ResultsMeloxicam and celecoxib inhibited the proliferation of Bgc-823 cells in both dose-dependent manner and time-dependent manner. Celecoxib has more potent effect than meloxicam. Celecoxib could induce apoptosis of Bgc-823 cells, which were blocked in G0/G1 phase. The apoptosis rate increased with the rising concentration of celecoxib, and the proportion of Bgc-823 cells in G0/G1 phase increased. ConclusionsSCIs can inhibit cell proliferation in Bgc-823 cells in both concentration-dependent manner and time-dependent manner. The mechanism may be dependent on the inhibition of COX-2 expression. SCIs affect cell cycles and induce Bgc-823 cell apoptosis in dose-dependent manner.

　　Key words： gastric carcinoma; cyclooxygenase-2; proliferation; apoptosis; cell cycle

　　近年来研究表明环氧合酶-2(COX-2)与肿瘤关系密切，选择性COX-2抑制剂具有抗癌细胞增殖活性、诱导癌细胞凋亡的作用[1]。为了解选择性COX-2抑制剂是否对人胃癌细胞也具有相同作用，我们设计了本实验，以比较2种选择性COX-2抑制剂——美洛昔康、塞来昔布对培养的胃癌细胞系的作用。希望从中观测到选择性COX-2抑制剂对胃癌细胞的抑制作用，并初步探讨其机制，从而为当前肿瘤的治疗及临床制定肿瘤的治疗方案提供理论依据。

　　1材料和方法

　　1.1材料RPMI1640培养液(Gibco公司)。新生牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)。胰蛋白酶、四甲基偶氮唑蓝(Amresco公司)。人胃癌细胞株Bgc-823由南京凯基生物科技发展有限公司提供。美洛昔康购自浙江仙琚制药股份有限公司。塞来昔布购自辉瑞制药有限公司。

　　1.2方法

　　1.2.1细胞培养Bgc-823细胞培养于10%新生牛血清的RPMI1640培养液中,在37℃，5%CO2、饱和湿度条件的二氧化碳培养箱中培养,实验取用对数生长期的细胞。

　　1.2.2四唑盐比色实验法(MTT法)测定细胞生长抑制率取对数生长期的细胞稀释成5.0×107个/L分种于96孔培养板，培养24 h后换含药培养基，分4个浓度(25、50、100、200 μmol/L)，同时设立空白对照组。每个浓度设4个平行孔。放入培养箱中孵育48、72 h后在酶标分析仪上测定其在570 nm处的光密度值(D值)。按下列公式计算细胞抑制率：细胞抑制率=(1-药物处理孔的D值/对照孔的D值)×100%。

　　1.2.3流式细胞仪检测细胞凋亡率及细胞周期因MTT法提示塞来昔布对细胞生长的抑制作用强于美洛昔康，故选用塞来昔布进行细胞凋亡率及细胞周期的测定。取对数生长期的细胞接种于6孔板内，加入不同剂量的塞来昔布，细胞各孔终浓度分别为25、50、100、200 μmol/L。同时设立空白对照组。培养48 h后，采用碘化丙锭一步插入性DNA定量荧光染色法检测凋亡细胞，观察细胞周期分布的情况。在细胞周期(G0、G1、S、G2、M)的各个时期，DNA的含量随各时相呈现出周期性变化。通过核酸染料标记DNA，并由流式细胞仪进行分析，可以得到细胞各个时期的分布状态，计算出G0/G1，S及G2/M的百分比。

　　1.3统计学分析采用SPSS 13.0软件完成，计量资料以±s表示。两组计量资料采用t检验，多组计量资料采用方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2结果

　　2.1对胃癌细胞增殖活性的影响2种选择性COX-2抑制剂均能降低Bgc-823细胞的D值，且这种效应呈剂量及时间依赖性(P<0.05)(表1)。且塞来昔布的降低作用更明显(P<0.05)。表1Bgc-823细胞经不同浓度美洛昔康、塞来昔布处理48 h、72 h后的抑制情况

　　2.2塞来昔布对胃癌细胞凋亡的作用以25 μmol/L塞来昔布处理Bgc-823细胞48 h后，凋亡率为2.9%±0.5%，与空白对照组比较差异无显著性。以50、100、200 μmol/L塞来昔布处理Bgc-823细胞48 h后，凋亡率分别为7.2%±2.1%、22.4%±1.8%和35.7%±1.1%，与空白对照组(2.3%±0.7%)比较差异有显著性(P<0.05)。

　　2.3塞来昔布对胃癌细胞周期的影响Bgc-823细胞经各浓度塞来昔布处理48 h后，随着药物浓度的增加，G0/G1期细胞比例增加，S期细胞比例减少(表2)。表2Bgc-823细胞经不同浓度塞来昔布处理48 h后的细胞周期结果

　　3讨论

　　近年来研究发现，COX-2在多数胃癌组织和胃癌细胞株中呈高表达。体外研究亦证实选择性COX-2抑制剂可以抑制胃癌细胞系的增生[2]。在本实验中，美洛昔康、塞来昔布可以影响Bgc-823细胞的生长，抑制作用呈时间、剂量依赖性，且塞来昔布的作用明显强于美洛昔康，经塞来昔布作用72 h后其细胞抑制率最高为78.3%。

　　之前有对胰腺癌的研究显示[3]，选择性COX-2抑制剂不仅抑制胰腺癌细胞生长，还能促进其凋亡，生长抑制率及凋亡率与对COX-2的选择性呈明显正相关;塞来昔布对COX-2的选择性高于美洛昔康。本实验的结果与之前的研究结果较一致。

　　细胞周期中检测DNA损伤的检测点至少有两处：一处在G1-S过渡期，可以防止DNA受损的细胞进入复制DNA的S期;另一处在G2-M过渡期，可以防止受损的DNA和未完成复制的DNA进入有丝分裂期[4]。G0/G1期是细胞周期的2个检查点之一，多种化疗药物可引起细胞G0/G1期的阻滞。G0/G1期阻滞是DNA修复期，可以使损伤的DNA在染色体分离前得到修复，不能修复者则进入凋亡阶段。抗癌药物作用于肿瘤细胞后并不能直接激活细胞死亡程序，多数诱导细胞凋亡的抗癌药最初是影响细胞的增殖潜能，细胞周期调节蛋白的破坏可使一部分细胞出现细胞周期停滞。本实验中，Bgc-823细胞经塞来昔布作用后显示G0/G1期细胞增多，S期细胞减少。这提示塞来昔布具有明显G0/G1期阻滞作用。

　　虽然研制和开发COX-2抑制剂是现今肿瘤治疗的一个热点，但COX-2抑制剂降低结肠癌、胃癌发病率的机制仍不是特别清楚[5]。一般认为，诱导凋亡和生长停滞是其抑制肿瘤生长的两个主要机制。就目前研究成果分析，我们认为COX-2抑制剂抑瘤作用的一种可能的原因就是改变了花生四烯酸的代谢，COX-2抑制剂与COX上特异的结合位点结合，阻断了前列腺素(PG)的合成，从而抑制了肿瘤的合成。有不少资料报道PGE2与肿瘤的发生关系密切，许多恶性肿瘤具有较正常组织高的分泌PGE2的能力[6]。有研究发现塞来昔布可显著抑制胆管癌细胞QBC939释放PGE2并且塞来昔布抑制胆管癌细胞QBC939生长和诱导凋亡的作用能被PGE2所拮抗[7]，因此塞来昔布可能通过抑制COX-2酶催化活性而减少PGE2产生，从而抑制癌细胞生长。随着研究的深入，有人认为COX-2并不是此类药物治疗肿瘤的惟一靶点。此类药物的抑癌作用也许是通过PG以外的途径而起作用的[8-9]。

　　对COX-2抑制剂的研究结果显示，COX-2抑制剂与化疗药联用会取得比单用一种药物更好的效果。这为临床上扩大COX-2抑制剂的使用范围，以这种联合化疗方案用于胃癌治疗提供了实验室依据。以往非选择性的COX抑制剂有较严重的副作用，但选择性COX-2抑制剂对各个系统的副作用已显著降低。

　　总之，选择性COX-2抑制剂的抗肿瘤作用途径可能是多方面的，其对COX-2的抑制作用可能仅仅是其中之一。新型选择性COX-2抑制剂，有望成为胃癌防治的有效手段。

　　【参考文献】

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