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消化系统肿瘤新标志抗survivin抗体的临床应用

发表时间：2011-07-19 浏览次数：375次

　　作者：王小平，秦力维，郭建巍，马骢，杨霄鹏，吕同德，高福兴，刘敏作者单位：1海军总医院检验科,北京 100037,2张掖市人民医院消化科,甘肃张掖 730070, 兰州军区兰州总医院: 3眼科中心,4实验科,甘肃兰州 730050

　　【摘要】　　目的: 建立生存素(survivin)抗体的检测方法，并进行临床标本检测. 方法: 用镍离子亲和层析纯化的survivin融合蛋白包被酶标板，建立基于重组融合蛋白的抗survivin抗体检测方法，并对434份血清标本进行检测，其中包括204例消化系统肿瘤, 186例癌前病变和44例正常对照. 结果: 在204例消化系统肿瘤中，甲胎蛋白(AFP)和癌胚抗原(CEA)的阳性率分别为14.2%和16.7%，抗survivin抗体阳性率为30.9%，本方法的特异度为93.6%; 在肠癌中CEA阳性率为11.1%(6/54), 抗survivin抗体阳性率为44.4%(24/54, P<0.05);在胃癌中CEA阳性率为20%, 抗survivin抗体阳性率为33.3% (P>0.05);在食管癌中, 抗survivin抗体阳性率高达40%, CEA阳性率仅为6.7% (P<0.05). 在186例癌前病变中, 抗survivin抗体阳性率31.7%, AFP和CEA阳性率分别为10.8%和16.7%;在消化性溃疡患者中, 抗survivin抗体和CEA阳性率均为33.3%;在直肠息肉中抗survivin抗体阳性率33.3%，CEA的阳性率仅为5.6% (P<0.05);在慢性结肠炎患者, 抗survivin抗体阳性率40%，CEA阳性率20% (P<0.05). 结论: 建立的抗survivin抗体检测方法和对消化系统肿瘤抗survivin抗体检测的基础资料，可为抗survivin抗体作为消化系统肿瘤新标志分子研究奠定基础.

　　【关键词】存活素,融合蛋白,肿瘤标志,间接ELISA法,消化系统肿瘤

　　【Abstract】 AIM: To establish an indirect ELISAbased method for detecting the antisurvivin antibody in sera of patients with digestive carcinomas and to discuss its clinical value. METHODS: An indirect ELISA was established by coating recombinant survivin protein purified with NiNTA agarose affinity chromatography. Then 434 serum samples from digestive cancer patients (n=204), precancerous lesion patients (n=186) and normal subjects (n=44) were detected and analyzed. RESULTS: The positive rates of alpha fetoprotein (AFP), carcinoembryonic antigen (CEA) and antisurvivin antibody in the sera of 204 patients of digestive carcinomas were 14.2%, 16.7% and 30.9%, respectively. The specificity of this method was 93.6%. CEA and the elevated antisurvivin antibody were detected in 11.1% (6/54) and 44.4% of intestinal carcinoma specimens (24/54, P<0.05). The positive rates of CEA and antisurvivin antibody in gastric carcinoma specimens were 20% and 33.3% (P>0.05). Antisurvivin positive patients were 6 of 15 (40%) and CEA positive patients were 1 of 15 (6.7%, P<0.05) in esophageal carcinoma. The positive rates of AFP, CEA and antisurvivin antibody in 186 patients with precancerous lesions of digestive system were 10.8%, 16.7% and 31.7%, respectively (P<0.05). The positive rates of CEA and antisurvivin antibody in patients with peptic ulcer were both 33.3%. Antisurvivin positive rate was 33.3% (24/72) and CEA positive rate was 5.6% (3/72, P<0.05) in patients of proctopolypus. In patients of chronic colitis, CEA and the elevated antisurvivin antibody were detected in 6 of 30 (20%) and 12 of 30 specimens (40%, P<0.05). CONCLUSION: The detection method of antisurvivin antibody and the data got in the study of the antibody prevalence in carcinomas of digestive system provide an important basis for further research on antisurvivin antibody as a tumor marker.

　　【Keywords】 survivin,fusion protein,tumor marker,indirect ELISA,digestive system neoplasms

　　0 引言

　　生存素(survivin)是一种哺乳动物凋亡蛋白抑制因子(inhibitor of apoptosis protein, IAP), 它主要通过抑制凋亡中主要的效应蛋白酶Caspase3和Caspase7来介导抑制细胞凋亡. 由于其独特的蛋白和基因结构以及与效应细胞蛋白酶受体1 (effector cell protease receptor1, EPR1)的特殊关系, 在肿瘤组织中的高选择性分布以及抗凋亡机制, 已成为近年来肿瘤研究的热点. 我们用表达的survivin融合蛋白，建立了基于重组survivin融合蛋白的、检测肿瘤患者血清中抗survivin抗体的间接ELISA方法，并探讨抗survivin抗体作为消化系统肿瘤新标志分子的可能.

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　pET32a(+)/survivin/BL21载体为本室构建;羊抗人IgGHRP为本室制备;TMB显色剂A，显色剂B由本实验室配制. 正常人血清来自身体健康，体检无异常，临床各项生化指标均正常者44例, 年龄18~50岁，男女各半;慢性癌前病变患者186例, 年龄18~50岁，男女各半，组织类型通过病原学或病理诊断所证实;各类消化系统肿瘤患者204例, 年龄18~50岁，男女各半，肿瘤类型均被免疫组化所证实. 在3000 r/min 15 min分离血清储存于-80℃冰箱备用.

　　1.2 方法

　　用20 mg/L survivin蛋白(纯度>90%)包被ELISA板，于4℃过夜并封闭，加入1∶100稀释的肿瘤患者血清100 μL, 37℃ 1 h，PBST洗板4次，加入1∶1000羊抗人IgGHRP 50 μL 37℃ 45 min，PBST洗板4次，以TMB底物显色后，于波长450 nm处测定A值. 以阴性血清A均值加2倍标准差作为阴性血清的临界值，高于此值的即判为阳性, 即测定的A450 nm≥0.104即判为阳性. 肿瘤患者血清中甲胎蛋白(alpha fetoprotein, AFP)和癌胚抗原(carcinoembryonic antigen, CEA)用Abbot公司AXSYM system测定.

　　统计学处理：率的比较用SPSS 11.0软件包进行χ2检验, P<0.05为差异有统计学意义.

　　2 结果

　　2.1 抗survivin抗体的ELISA检测

　　检测健康血清44份, A450 nm为0.002~0.096(平均0.0497±0.0227), 血清中抗survivin抗体A450 nm均低于临界值. 消化系统肿瘤患者血清204份，抗survivin抗体阳性率为30.9%，AFP和CEA的阳性率分别为14.2%和16.7%. 在186例癌前病变中, 抗survivin抗体阳性率为31.7%, AFP和CEA阳性率分别为10.8%和16.1%(表1).表1消化系统疾病患者血清抗survivin抗体的变化(略)

　　2.2 抗survivin抗体与AFP和CEA的比较

　　AFP，CEA阳性的判断标准分别为25和15 mg/L，抗survivin抗体和AFP或CEA同时都为阳性的病例数较少,抗survivin抗体在消化系统肿瘤患者血清中的阳性表达要多于AFP和CEA (P<0.05).

　　3 讨论

　　survivin基因只在绝大多数肿瘤组织中表达，在100多种肿瘤相关基因中， survivin基因表达的特异性列居前4位[1]. survivin基因在肺癌、结肠癌、胰腺癌、肝癌、胃癌、前列腺癌及乳腺癌等所有人类常见恶性肿瘤中的表达率为30%~100%[2-3]. 我们对胃癌的检测结果显示, survivin基因在中分化腺癌的表达为91.7% (66/72)，低分化腺癌表达为90% (54/60)，两者差异无统计学意义(P>0.05)[4]. survivin蛋白在结直肠癌的阳性率为53.2%，癌旁正常组织均无表达[5]. 既然survivin蛋白在正常组织中检测不到，而在肿瘤组织中高表达，那么肿瘤患者的免疫系统就有可能将其识别为非自身抗原，从而激发特异性免疫应答，因此从肿瘤患者血清中检测抗survivin抗体可用于肿瘤诊断. 膀胱癌患者中体内抗survivin抗体高于健康人[6];HCV感染的原发性肝癌患者体内抗survivin抗体高于健康人和HBV感染的原发性肝癌患者[7].

　　我们的结果显示，在204例消化系统肿瘤患者中，血清抗survivin抗体阳性率为30.9%;消化系统肿瘤慢性癌前病变(消化性溃疡、慢乙肝肝硬化、慢性结肠炎、直肠息肉)患者血清中抗survivin抗体的阳性率为31.7%. 本方法检测消化系统肿瘤患者血清中抗survivin抗体的灵敏度为59.1%，特异度为93.6%. 我们还发现, 抗survivin抗体在胃癌中的阳性率为33.3%(15/45),远远低于我们前期的免疫组化结果(大于90%). 可能的原因是survivin蛋白主要存在于胞质和胞核中,而体液中游离survivin蛋白含量很低,难以诱发有效的免疫应答.

　　本研究中肠癌患者CEA阳性率为11.1%，低于国内有关报道26%~72%[8],可能与肿瘤不同治疗阶段和分化程度有关;在食管癌中，CEA阳性率为7%,抗survivin抗体阳性率为40.0% (χ2=4.65, P<0.05),抗survivin抗体优于CEA.以上数据提示，在胃癌、肠癌及食管癌的诊断中,抗survivin抗体同AFP和CEA联合检测，更有利于上述肿瘤的早期诊断.

　　【参考文献】