糖尿病小鼠肝线粒体氧化损伤及其机制

　　　作者：张蕾 庄晓燕 陈顺志 白秀珍 刘树森 作者单位：辽宁医学院 锦州121001

　　【摘要】 目的: 糖尿病是威胁人类健康的主要疾病之一，为了证明糖尿病的发生发展与氧化应激密切相关，从线粒体呼吸链角度探讨其机制。方法：用四氧嘧啶(Alloxan)建立实验性糖尿病小鼠模型，利用比色法分别从整体、组织和线粒体水平测定抗氧化酶活性，用铁氰化钾脉冲法测定线粒体呼吸活链II+III电子传递与质子泵出偶联(H+/2e)。结果： 糖尿病小鼠GSH、 GSHPx分别比对照组显著降低(P<0.001)，血清和肝组织、线粒体GSHPx/MDA 比值分别降低59.89%、40.69% 和59.65%;线粒体呼吸链II+III总H+/2e显著降低24.76%(P<0.05)，净H+/2e显著降低32.31%(P<0.05)。结论：实验性糖尿病小鼠肝功能损伤是氧化性损伤，氧化应激又是该损伤的结果，其原因与质子漏增加，电子传递与质子泵出脱偶联有关，导致自由基增加，无效耗氧增加，线粒体受损。

　　【关键词】 线粒体; 呼吸链; 糖尿病

　　现国内外一系列动物实验和临床研究表明糖尿病存在着明显的氧化应激[1]，确切原因尚不清楚，主要可能由于：①自由基产生增加。葡萄糖及糖化血红蛋白自氧化可产生自由基，线粒体结构、功能的损伤造成呼吸链电子传递与质子泵出偶联程度下降，电子漏增加,自由基生成增加。② 机体清除自由基系统功能减弱[7]。原因是抗氧化酶活性降低,抗氧化物质血浓度降低。正常情况下体内清除自由基的酶类如：SOD、GSHPx和小分子抗氧化剂如VitE、VitC、胡萝卜素、GSH及微量元素(硒、锌)对自由基及脂过氧自由基的清除能力减弱。③葡萄糖自动氧化产生的酮醛也可以进一步氧化修饰蛋白质，导致蛋白质结构和功能的改变而参与氧化应激[8]。氧化应激可进一步因组织损伤，细胞死亡以及自由基清除能力降低而加强。

　　近代生物学研究表明，线粒体不仅是细胞能量转化的中心，也是细胞内自由基的主要来源。线粒体电子漏作为机体自由基生成的重要途径，其重要性及生理意义已在生物力能学和自由基与医学领域内受到广泛关注。对线粒体电子漏的研究表明，它在生物衰老、疾病发生发展、细胞程序死亡中起着重要的作用。线粒体耗氧的2%～6%转化为自由基，包括超氧阴离子、单线态氧、羟自由基和过氧化氢等。活性氧在体内具有多方面的病理生理意义。一方面，它通过直接或间接途径参与许多疾病的发生与转归过程[2];另一方面，它又是正常的生理代谢产物，是生命活动所必需的[2]。因此生物体自由基的产生与清除的平衡，对维持体内维持体内生理性低浓度活性氧，又防止其浓度过高造成机体损伤是极其重要的。

　　综上所述,本研究从自由基的产生及清除两方面研究了糖尿病与氧化应激的关系，进一步探讨了自由基与糖尿病肝损伤的机理。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验性糖尿病模型的建立

　　1.1.1 实验动物 雄性昆明小白鼠，体重30±5g, 由中国科学院动物研究所试验动物中心提供，饲以该所提供的复合饲料。

　　1.1.2 Alloxan试剂的配制[3] Alloxan 应避光0～4℃ 保存，现用现配将Alloxan配制成1%的生理盐水溶液。

　　1.1.3 糖尿病动物模型建立[4] 选择健康昆明白小鼠20只(30±5g),饥饿24h后，尾静脉注射Alloxan无菌盐水注射液75mg/kg;对照组注射生理盐水溶液，72h后，用 One Touch2血糖仪测空腹血糖FPG>200mg/ml,初步确定为糖尿病模型。

　　1.1.4 长期高血糖病模型的筛选 将建立的糖尿病模型小鼠饲养3天后，筛选出长期维持在高血糖水平的小鼠。 血糖测定：采用 One Toutch II血糖仪测定。口服葡萄糖试验(OGTT)：饥饿5小时后，经口灌入50%的葡萄糖溶液，剂量2.5 g/kg[5]。观察0～4小时小鼠血糖变化，筛选出10只血糖维持在较高水平的长期高血糖病小鼠。

　　1.1.5 实验分组 正常对照组：正常健康昆明白小鼠，不加任何处理因素;糖尿病组：在注射Alloxan后经口灌入生理盐水，剂量1ml/只，2次/天，共15天。

　　1.2 组织线粒体的提取及膜蛋白定量[6]

　　用快速双缩脲法测定，用280nm下校正的BSA作标准。本法测定蛋白浓度在0.05～1.25mg/ml，室温下测定。

　　1.3 线粒体指标的测定

　　1.3.1 线粒体呼吸链电子传递与质子泵出比值(H+/2e)的测定[6] 依据文献[13]，采用铁氰化钾脉冲法测定。

　　1.3.2 线粒体丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量、谷胱甘肽(Glutathione,GSH)含量、谷胱甘肽过氧化物酶(Glutahione peroxidase,GSHPx)活力的测定 使用南京建成生物研究所提供的试剂盒，用比色法测定。

　　1.4 肝脏组织匀浆的制备和蛋白定量[6]

　　1.5 肝组织MDA 含量、GSH 含量、GSHPx 活力的测定

　　均使用南京建成生物研究所提供的试剂盒，用比色法测定。

　　1.6 血液样品的制备

　　1.6.1 血浆的制备 小鼠摘除眼球取血，加入10mg/ml的肝素抗凝，离心10min，取上清。

　　1.6.2 溶血液的制备 取小鼠新鲜血液，加入双蒸水，混匀。

　　1.7 血液指标的测定

　　血浆中 MDA 含量、GSHPx 活力的测定及溶血液中 GSH 含量的测定均使用南京建成生物研究所提供的试剂盒，用比色法测定。

　　1.8 统计学处理

　　实验数据SPSS统计软件包处理，计算均值及标准差(±s)，t检验，组间显著差异P<0.05有为统计学差异，P<0.01为显著统计学差异，P<0.001为极显著统计学差异。

　　2 结果与分析

　　2.1 空腹血糖

　　用Alloxian造模后，小鼠的空腹血糖比正常小鼠空腹血糖增高，两者有极显著性差异，P<0.001。

　　2.2 口服葡萄糖耐量试验(OGTT )

　　正常鼠与糖尿病鼠饥饿5h后口服葡萄糖，0.5～1h后血糖迅速升高，但在2h后，正常对照组血糖恢复到正常水平。而实验组血糖仍维持在一个较高水平，说明前者胰岛β细胞分泌胰岛素功能正常，能调控血糖到正常水平。而糖尿病鼠1h后，糖尿病组血糖也有所下降但不能恢复到正常水平,说明胰岛β细胞部分受到破坏，但还有一部分能行使其功能。

　　2.3 线粒体GSH含量、GSHPx活性、MDA含量、GSHPx/ MDA

　　糖尿病组肝线粒体GSH含量、GSHPx活性与正常对照组相比显著降低， P<0.001;MDA含量显著增高，P<0.001;糖尿病组GSHPx/ MDA比正常对照组显著降低，P<0.001。

　　2.4 肝线粒体呼吸链复合体Ⅱ+Ⅲ电子传递与质子泵出偶联状况

　　表3 糖尿病状态下肝脏线粒体呼吸链复合体Ⅱ+Ⅲ电子传递与质子泵出偶联状况的变化(略)

　　由表3可见糖尿病组总H+/2e、净H+/2e均比正常对照组显著降低，P<0.05。

　　2.5 肝组织GSH含量、GSHPx活性、MDA含量、GSHPx/ MDA

　　表4 糖尿病状态下肝脏组织GSHPX活性、MDA含量的变化(略)

　　注： * 与对照组相比，P<0.001, #与对照组相比，P<0.01。

　　由表4 可见，糖尿病组肝组织GSH含量和GSHPx活性与正常对照组相比显著降低，P<0.001;MDA含量显著增高，P<0.01;GSHPx/ MDA明显下降，P<0.01。

　　2.6 血液GSH含量、GSHPx活性、MDA含量、GSHPx/ MDA

　　由表5 可见，糖尿病组血清GSH含量、GSHPx活性比正常对照组均显著降低，P<0.001;MDA含量显著增高，P<0.001;GSHPx/ MDA显著降低，P<0.001。

　　注：* 与对照相比，P<0.001。

　　3 讨论

　　3.1 小鼠实验性糖尿病与氧化应激

　　我们用低剂量的Alloxan直接破坏小鼠胰岛β细胞，使胰岛素合成受阻，血糖升高，导致实验性糖尿病， 空腹血糖值(FPG)是筛选糖尿病模型的主要指标之一，但由于小鼠个体血糖波动范围较大，FPG 只能反应采血当时的血糖水平，所以要得到真实、可靠糖尿病模型，OGTT对其诊断极为重要。正常机体服葡萄糖后几乎全被肠道吸收，使血糖迅速上升，刺激胰岛素分泌，肝糖原合成增加，分解受抑制，肝糖输出减少，体内组织对葡萄糖的利用增加。所以，如图1 所示，正常组小鼠口服葡萄糖30～60min后血糖浓度达到高峰，以后血糖浓度迅速下降，在2h下降到接近正常的水平。而实验组则显示出口服葡萄糖耐量降低，反映胰岛β细胞功能障碍对高血糖不敏感,说明所建立的糖尿病模型是可靠的。

　　GSH是一种非蛋白抗氧化剂，是机体内非蛋白巯基化合物数量最多和巯基数最高的化合物。 GSH在整个机体氧化还原链中和维持机体内环境处于自稳态方面起着关键性作用，是一个极为重要的抗氧化剂。MDA是脂质过氧化分解的一种产物，其含量随机体氧自由基量的增加而增加，是机体受氧化损伤指标之一，这种醛式产物对细胞及其成分的毒性效应非常大。GSHPx作为体内主要抗氧化酶之一，其主要作用是清除脂质氢过氧化物，并在过氧化氢酶含量很少或H2O2含量很高的组织中，可代替过氧化氢酶清除H2O2，保护生物膜的结构和功能。

　　检测血液、肝组织、线粒体3种水平的GSH含量、MDA含量和GSHPx活性，均有显著性差异 。如表2、表4、表5 所示，糖尿病组GSH含量、GSHPx 活性显著低于正常组，表明机抗氧化能力下降而处于氧化应激状态。从实验结果分析实验性糖尿病小鼠机体潜在抗氧化能力(GSHPx/MDA) 下降，与对照相比，具有显著性差异，这更说明了实验性糖尿病小鼠存在氧化损伤。

　　在糖尿病持续高血糖状态中，葡萄糖已不仅是一种能源物质，而且还作为毒性物质促使机体处于氧化应激状态，现已证明，在有微量金属离子(铁、铜等)作用下葡萄糖能自动氧化产生自由基[7]，从而对机体组织造成损伤。

　　3.2 线粒体电子传递与质子泵出偶联状况的改变

　　线粒体内膜呼吸链的电子传递是和质子跨膜转运相偶联的。如果其它条件没有改变，而质子跨膜转运数目降低，将导致能转化为ΔP再转化为ΔGp(高能磷酸能)的有效ΔEh比值减小，而以热能形式散失的自由能增加。推测与作为质子泵的复合体Ⅱ和复合体Ⅲ功能下降有关。我们在实验中观察到，如表3 所示，糖尿病状态下肝脏线粒体呼吸链复合体Ⅱ+Ⅲ复合物电子传递与质子泵出比值(H+/2e)明显降低，表明线粒体呼吸链电子传递与质子泵出偶联程度下降。

　　在本实验中H+/2e明显降低的原因可能是自由基及脂质过氧化的直接损伤。自由基可直接与膜蛋白和/或受体蛋白共价结合，改变膜成分活性;氧化蛋白质巯基;过氧化产物如MDA与酶交联成Schiff氏碱，使酶丧失其活性[8]，降低其质子泵功能，使H+/2e下降，线粒体呼吸链电子传递与质子泵出偶联程度降低。造成用于产热的氧耗增多，无效氧耗增加。

　　综上所述，在实验性糖尿病小鼠肝细胞中存在氧化损伤，机体抗氧化能力下降，而线粒体是氧化损伤的靶器官，影响细胞组织器官整体的功能状态。导致线粒体呼吸链电子传递与质子泵出偶联功能下降，可见糖尿病的发生发展都于自由基有关。

　　致谢：本实验是在中国科学院动物研究所生物膜与膜生物国家重点实验室完成的，感谢刘树森研究员对本实验的指导和大力支持。

　　【参考文献】

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