精神分裂症患者血清蛋白表达差异的研究

精神分裂症(schizophrenia)是一种常见精神病，主要表现为环境和精神活动不协调[1]。目前进行强制医疗措施或司法鉴定时，由于没有客观的检测方法，往往会存在主观判断性太强的局限性。而表面增强激光解吸电离飞行时间质谱(SEL DI TOF MS)技术具有高效、快速、灵敏地检测微量蛋白的特点。利用该技术，本课题组在筛选精神分裂症蛋白标志物上取得了一定成果[23]。该实验对精神疾病进行分组比对研究，筛选出差异表达的血清标志蛋白，并探讨其临床价值。1　资料与方法1.1　标本来源　取自于泸州医学院附属医院2009年3 月至2010年3月门诊健康查体者和精神疾病住院患者血清标本总共145例。精神疾病组124例，其中器质性精神障碍11例，抑郁症14例，焦虑障碍30例，精神分裂症33 例，精神分裂症直系亲属36例。健康体检对照组21例。1.2　主要试剂与仪器　无水醋酸钠(sodiumacetate)、磷酸盐缓冲液(PBS buffe)、尿素(urea)、3 环乙胺 1 丙磺酸(CHAPS)、芥子酸(sinapinicacid)、三氟乙酸(TFA)、二硫苏糖醇(DTT)、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液(TrisHCl)、1mol/L 盐酸(HCl)、氢氧化钠(NaOH)均购自美国Sigma公司。乙腈(acetonitrile)购自Fluka 公司。蛋白质指纹图谱分析仪(PBS Ⅱ/C)、CM10 蛋白芯片由Ciphergen 公司提供。1.3　方法1.3.1　精神疾病诊断标准　抑郁症、焦虑障碍和精神分裂症患者诊断标准使用第10版的《国际精神疾病分类与诊断标准》(ICD10)，简明精神病评定量表(BPRS)评分大于或等于30分且无躯体疾病伴发。所有标本采用清晨空腹静脉血。1.3.2　实验方法　按照Ciphergen公司提供的实验室操作规程完成，具体参照本课题已发表的报道[2]。采集数据：为检测结合在CM10 芯片表面的血清蛋白质，使用PBSⅡ/C 型蛋白质指纹图谱仪，调定最高检测相对分子质量为100×103，优化范围为(2～20)×103，激光强度220，检测敏感度为9。然后再用BiomarkerWizard3.1 版本软件进行健康对照组和精神疾病组的蛋白质指纹图谱差异分析。1.4　统计学处理　采用CiphergenProteinehip 软件对采集到的血清图谱进行分析并计算出差异性，并以变异系数(犆犞)值表示，设定犆犞<15%时，不同芯片之间的实验误差为可接受范围。使用BiomarkerWizard3.2 软件分析评估对照组和精神分裂症组的血清蛋白质指纹图谱，设置有意义的蛋白质峰出现频率阈值为10%，分别设置2次信噪比过滤，第1次为5，第2次为2。确定这两组间蛋白质峰值比较时，对初筛的蛋白质峰进行狋检验，犘<0.05时差异具有统计学意义。2　结　　果2.1　差异蛋白质峰的检测　通过上述方法对各组间进行两两比较，筛选出差异有统计学意义的蛋白质峰15个(犘<0.01)，见表1。2.2　145例样品的差异蛋白质峰统计　(1)2221.92 为精神分裂症特征性表达降低的蛋白质。(2)9186.42、3116.9 和2058.06为精神分裂症特征性表达增高的蛋白质组。(3)焦虑障碍组有16个差异蛋白质与精神分裂症平行表达。(4)抑郁症组有2个多肽(2093.81和2159.68)同精神分裂症一样表达增高。(5)器质性精神障碍组有3 个多肽(3 168.95、2093.81和2159.68)也同精神分裂症一样表达增高。(6)精神分裂症直系亲属组中2093.81同其他精神疾病组一样表达增高但健康对照组不增高。2.3　查阅蛋白数据库鉴定结果　通过查询蛋白数据库(http//us.expasy.org/tools/tagident.html)，相对分子质量项(Mw)输入筛选得到的15 个相对分子质量数值，种类项输入 “homosapiens(人类)”，并以质量偏差为0.1%(与试验仪器质量偏差一致)。具体检索结果见表2。3　讨　　论目前为止，引起精神分裂症的分子机制仍未阐明。研究人员认为，在诸多精神分裂症的致病因素中，遗传因素起主导作用，它对该病的影响占到70%[4]。而基因组研究揭示了不同的病理和生理情况下精神分裂症的基因表达状况，表明精神分裂症患者表现出异常的基因表达[5]。蛋白质作为基因表达的最终产物也随之变化，并具有特异性[6]。本研究利用CM10芯片和SELDITOFMS技术对精神分裂症患者和健康人血清蛋白进行比对筛查，发现差异有统计学意义的蛋白质峰15个(犘<0.01)。然而，本研究的不足之处在于未对以上蛋白质水平进行盲法模型验证，此外研究标本量偏小、影响其检验效能，需要扩大标本量来检测并进行随访观察;患者的人口学特点、病程、治疗、疾病严重程度对蛋白质的影响不明。综合国内外文献，普遍认为精神分裂症是由遗传基因介导的神经系统发育异常而引起的疾病，寻找易感基因是研究该疾病的重要方法之一[7]。现代芯片技术和蛋白质组学技术分别研究cDNA 和蛋白质，它们都具有高通量、高分辨率等特点，是研究基因与蛋白质之间相互作用的潜在技术[8]。最近的实验证实了编码N 乙基马来酰亚胺敏感因子和突触蛋白synapsinⅡ、synaptojanin1、synaptotagmin5的基因在一组精神分裂症患者的背侧前额皮质中表达水平偏低[9]。另外，芯片研究实验得到的最一致的结果是RGS4在精神分裂症患者的背侧前额皮质中表达水平下调[10 11]。故寻找差异性表达的基因和蛋白之间的关联将可以进一步验证筛选出的15个蛋白质在精神分裂症中差异表达的真实性，对研究精神分裂症的分子发病机制和诊断具有一定参考价值。参考文献[1] 韩柏.精神分裂症的现代研究[M].北京：中国科学技术出版社，2003：2 12.[2] 姜伟，王开正，蔡美珠，等.精神分裂症血清蛋白指纹图人工神经网络诊断模型研究[J].中国神经精神病学杂志，2008，34(1)：27 30.[3] 丁银环，胡琼英，梁双花，等.运用内标校准法提高表面增强激光解吸电离飞行时间质谱检测中的重复性[J].中华检验医学杂志，2009，32(3)：337 339.[4] ReinhartBJ，SlackFJ，Basson M，etal.The21 nucleotidelet 7RNAregulatesdevelopmentaltiminginCaenorhab ditiselegans[J].Nature，2000，403(6772)：901 906.[5] LiH，ZhangX，GuoY，etal.Acasecontrolstudyofge neticassociationofthePLA2G4Agenewithschizophreni ainaChinesepopulation[J].PsychiatrGenet，2007，17(3)：205 209.[6] SteinerJ，Bielau H，Bernstein HG，etal.Increasedcere brospinalfluidandserumlevelsofS100Binfirst onsetschizophreniaarenotrelatedtoadegenerativereleaseofglialfibrillaracidicprotein，myelinbasicproteinandneu rone specificenolasefrom gliaorneurones[J].JNeurolNeurosurgPsychiatry，2006，77(11)：1284 1287.[7] RowlandL，BustilloJR，LaurielloJ.Protonmagneticreso nancespectroscopy(H MRS)studies ofschizophrenia[J].SeminClinNeuropsychiatry，2001，6(2)：121 130.[8] VawterMP，CrookJM，HydeTM，etal.Microarrayanal ysisofgeneexpressionintheprefrontalcortexinschizo phrenia：apreliminarystudy[J].SchizophrRes，2002，58(1)：11 20.[9] GogosJA，Morgan M，LuineV，etal.Catechol O methyl transferasedeficientmiceexhibitsexuallydimorphicchan gesincatecholaminelevelsandbehavior[J].Proc NatlAcadSciUSA，2008，95(17)：9991 9996.[10]MarcotteER，SrivastavaLK，Quirion R.DNA microar raysinneuropsychopharmacology[J].TrendsPharmacolSci，2011，22(8)：426 436.[11]PattersonSD，AebersoldRH.Proteomics：thefirstdecadeandbeyond[J].NatureGenetics，2003，33(Suppl)：311 323.