犬肝硬化门静脉高压征食管静脉曲张模型的建立及评价

　　作者：王艳梅，李楠，王雅文，王欣，张林 作者单位：(解放军总医院第二附属医院 消化科，北京 100091)

　　【摘要】目的 食管胃底静脉曲张动物模型的建立，对研究如何预防和治疗门脉高压征食管胃底静脉曲张出血具有重要意义。本研究目的在于建立犬门脉高压征食管静脉曲张动物模型并加以评价，为下一步探索临床治疗方法提供可靠、稳定的模型动物。方法 10条健康成年雄性杂种犬为研究对象，以胆总管结扎术加CCl4法建立门脉高压征食管胃底静脉曲张动物模型。同时采用一系列的检查方法加以评估。结果 10条犬存活8条，经胃镜检查证实，所有存活动物均形成食管静脉曲张，其中轻度2例，中度4例，重度2例。与术前相比，肝功能显著异常，门静脉压力明显升高，差异具有显著统计学意义(P<0.01)。门脉高压性胃病达58%。 结论 本组方法简单易行，模型质量可靠，制备周期明显缩短。该方法可形成稳定的肝硬化门脉高压征食管静脉曲张模型，可用于该方面的相关研究。

　　【关键词】 犬;动物模型;食管静脉曲张;门脉高压征

　　Establishment and Evaluation of Esophageal Varices in Dogs with Portal Hypertension

　　Wang Yanmei, Li Nan, Wang Yawen, Wang Xin, Zhang Lin

　　(Department of Gastroenterology, Second Affiliated Hospital of PLA General Hospital, Beijing 100091, China)

　　Abstract： Objective To develop and evaluate the canine model of esophageal varices with portal hypertension for successive study on the treatment of bleeding caused by esophageal varices.Methods Ten healthy adult mongrel dogs were used in the study. Esophageal varices were established by complete ligation of common bile duct and injection of CCL4.Results After operation, 8 in 10 dogs survived for six to eight weeks. All the dogs who survived had developed esophageal varices that were demonstrated by endoscopy, i.e. mild in two, middle in four, and severe in two. Their liver function was abnormal, and the average portal pressure was significantly higher than that of controls. The number of veins and the vessel area in esophageal submucosa of the trial dogs increased significantly, compared with that of the controls (P<0.01).Conclusion The procedure is fairly stable and reliable, the model is useable for research in esophageal varices. Compared with other methods, our procedure is simpler and easier, and the period of production is much shorter. Furthermore, the model quality is reliable and stability.

　　Key words： canine; animal model; esophageal varices; portal hypertension

　　由于病毒性肝炎、酒精性肝病等原因造成的慢性肝病和肝硬化逐渐增多，肝硬化一直是消化学界的研究热点。其中，门脉高压征食管胃底静脉曲张破裂出血(esophagogastric variceal bleeding，EGVB)是消化科的急重危症，病情危笃，死亡率高，如何控制其出血并防止再发出血，降低死亡率，仍是临床工作者需要解决的一大难题。随着科学技术的发展，很多新的治疗方法临床应用之前必须进行实验研究。因此，建立大动物门脉高压征食管静脉曲张模型具有重大的意义[1]。本文采用胆总管结扎术加CCl4法制备成犬门脉高压征食管静脉曲张的动物模型，进行实验观察和评价，为以后的实验研究奠定基础。

　　1 材料和方法

　　1.1 实验动物

　　10条健康成年雄性杂种犬为研究对象， 体重8～10kg。 动物由解放军总医院第二附属医院实验动物中心提供。术前静脉抽血测肝功能、肾功能和血常规。

　　1.2 模型建立方法

　　(1)胆总管结扎术(common bile duct ligation，CBDL)：手术前晚禁食，肌注速眠新(0.1 ml/kg)和氯胺酮(0.1 ml/kg)麻醉，固定于手术台。15%硫化钠溶液脱毛，常规碘酒、乙醇消毒，取上腹正中切口入腹，自动拉钩向两侧牵开腹壁，门静脉位于右侧，其左侧上方为胆道，下方为肝动脉，三者呈“品”字排列。游离胆总管，然后用7号丝线双重结扎，并从中切断胆总管，避免再通。关腹。术后抗感染补液治疗。(2)用40%CCl4 0.2 ml/kg 加入等量花生油，予腹腔内注射，每周1次，共16周。

　　1.3 术后观察方法

　　(1)一般观察：观察一般情况，术后并发症，营养状况，腹壁静脉形成情况。(2)B超检查：手术前、手术后6～8周腹部超声检查。(3)胃镜检查：术后3～4周开始每周胃镜检查1次,观察食管静脉曲张形成情况及有无门脉高压性胃病，曲张静脉大小按以下标准分类：①轻度：食管曲张静脉直径<2.5 mm 突入食管腔内;②中度：曲张静脉直径2.5～4 mm，突入食管腔内;③重度:曲张静脉直径>4 mm,突入食管腔内。观察食管黏膜、胃黏膜颜色，有无门脉高压性胃病。超声胃镜检查食管壁厚度和食管旁静脉。(4)术后门静脉造影：术后5周于DSA室行经皮经肝门静脉穿刺造影术了解门静脉压力情况。(5) 观察并发症情况。

　　1.4 病理学检查

　　切除食管、胃、肝、脾，并用10%甲醛固定，修整标本后常规脱水、透明、石蜡包埋;切片后行HE染色，显微镜下观察肝、脾组织学改变情况以及食管下段血管形态学的改变情况。

　　食管下段血管形态学观察指标：应用计算机辅助图像分析系统检测以下指标：(1)黏膜下血管数目，计算直径>20 μm 的血管;(2)黏膜下血管总截面积;(3)黏膜下单一血管的平均截面积为黏膜下血管总截面积与黏膜下血管数目比值。

　　1.5 统计学方法

　　应用SPSS10.0 for window统计软件分析，检测数据以均数±标准差(x±s)表示，计数资料采用配对t检验，计量资料组间比较采用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 术后一般情况

　　造模过程中，犬食欲下降，发育缓慢，逐渐消瘦，有2只犬于第4 周及第5 周死亡，分别死于营养不良和感染。

　　2.2 肝功能变化和门静脉造影结果

　　动物模型制备成功饲养5周后，动物空腹12 h，麻醉，DSA室经皮经肝门静脉造影，多导生理记录仪测量门静脉压力。见表1、2、图1。表1 肝功能监测(略)表2 门静脉压力测定(略)

　　2.3 彩色多普勒超声测量方法

　　术后5周进行彩色多普勒超声检查，动物禁食12 h 以上，麻醉取仰卧位。结果示：肝脏大小形态较术前无明显变化，分别测量门静脉主干(PV)内径为1.12 cm，血流速度4.61 cm/s，血流量272 ml/min。见图2。与术前比较门静脉内径增粗，血流速度增快，流量增加。

　　2.4 胃镜及内镜超声检查

　　术前常规胃镜检查，所有犬食管黏膜光滑，无静脉曲张，胃黏膜无充血水肿及溃疡。术后3～4周开始胃镜检查，1次/周，观察食管内曲张静脉形成，6～8周时曲张静脉大小稳定，10条犬中重度静脉曲张2条，中度4条，轻度静脉曲张2条。食管静脉形成率100%，只是轻重不同而已。7条犬有轻度门脉高压性胃病，但无出血、溃疡表现。胃镜微探头超声见食管壁黏膜层增厚，食管旁静脉、黏膜下静脉增粗。

　　2.5 术后病理学改变

　　胆汁性肝硬化门脉高压征模型犬肝脏病理及门脉血流动力学：犬肝脏肉眼可见体积增大，呈绿褐色，表面呈细颗粒状，质地变硬，胆囊极度扩张。光学显微镜下，HE染色切片上汇管区及小叶中央带明显纤维化，伴炎性细胞浸润，纤维组织向肝小叶内延伸，形成完全分隔型假小叶，胆管明显增生、扩张，有胆栓形成，肝细胞有不同程度变性、坏死，符合胆汁性肝硬化。

　　3 讨论

　　为了克服小动物肝硬化模型与人类器官功能结构、组织代谢特点相差较远以及不适合用于对某些手术治疗效果的观察。近年来,有关大动物肝硬化模型的实验得到深入开展[2]。门脉高压征是一组症候群[3]，是多因素共同作用的结果，这其中包括门脉系统阻力、血流量、液递物质以及其他一些因素。肝功能受到损害时，液递物质水平升高,内脏血流量增加,肝硬化患者肝功能受到破坏，门脉压力处于持续升高状态,因而食管静脉曲张不断加重，破裂出血的比例较高。在以往制作的动物模型中[4]，肝功能和肝脏结构基本正常，门脉系统高压力和高阻力状态不能长期维持，随着门腔侧支循环的建立，门脉高压状态可能会得到缓解，因而形成重度静脉曲张的比例不高。我们采用胆总管结扎术加CCl4法制做出更接近人类病理生理机制的大动物模型，为下一步的门脉高压征临床研究奠定了基础。

　　胆总管结扎术导致肝内型肝硬化门脉高压征动物模型，有明显内脏血流动力学异常及门腔侧支循环形成，病变不仅累及肝窦前，而且累及肝窦和肝窦后。其血流动力学紊乱、肝功能异常和肝脏病理改变与人小结节性肝硬化基本一致。胆总管结扎术加CCl4法：CCl4是最早、最广泛应用、最能诱导肝硬化的化学毒物。它经肝微粒体细胞色素p450激活生成CCl3，攻击肝细胞膜的磷脂，引起脂质过氧化破坏膜性结构[5];CCl3还与蛋白质形成共价键，损害线粒体，影响三羧酸循环致肝细胞“窒息”死亡;内质网受损则脂蛋白合成障碍，三酰甘油和脂肪酸在肝细胞内蓄积[6]。

　　肝硬化胶原纤维增生和结节形成的机制:胆总管结扎后胆汁郁积造成肝细胞损伤、坏死、激发小胆管样上皮细胞增殖并分化演变。大多数变成小胆管，少数变成小结节状肝细胞。小胆管样上皮细胞和小胆管上皮细胞具有合成胶原纤维的能力。增殖的小胆管、纤维母细胞、毛细血管等和伴随其增生的胶原纤维一起形成结缔组织隔，包围、分割、改建原来的肝小叶而形成假小叶，终于导致肝硬化形成。

　　【参考文献】

　　[1] 郭花，薛挥.肝硬化动物模型研究进展[J].中国比较医学杂志，2006，16(8)：499-501.

　　[2] Bertolini G, De Lorenzi D, Ledda G, et al. Esophageal varices due to a probable arteriovenous communication in a dog[J]. J Vet Intern Med, 2007,21(6):1392-1395.

　　[3] Laleman W,Nevens F.Cirrhotic portal hypertension: current and future medical therapy for primary and secondary prevention of variceal bleeding[J].Minerva Med,2006,97(4):325-345.

　　[4] Yin ZH, Liu XY, Huang RL, et al. Expression of TNFalpha and VEGF in the esophagus of portal hypertensive rats[J]. World J Gastroenterol,2005,11(8):1232-1236.

　　[5] Puckett JL, Liu J, Bhalla V, et al. Ultrasound system to measure esophageal varix pressure: an in vitro validation study[J]. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol,2005,288(5):G914-919.

　　[6] Jensen DM,Machicado GA,Hirabayashi K.Randomized doubleblind studies of polysaccharide gel compared with glue and other agents for hemostasis of large veins and bleeding canine esophageal or gastric varices[J].J Trauma,2004,57(Suppl):S33-37.